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实验目的 1．明确HIV／AIDS患者T淋巴细胞以及自然杀伤（NK）细胞膜表面CD226（mCD226）分子表达水平，与其它免疫活化指标水平变化相比较的特点； 2．明确HIV／AIDS患者血浆中可溶性CD226（sCD226）分子水平与mCD226表达变化的相关性； 3．明确mCD226／sCD226分子水平在评价HIV感染者机体免疫状态和疾病进程中的临床意义。 实验材料与方法 一、实验材料 1．材料： LeoAl（CD226-FITC）单克隆抗体（mAb）由第四军医大学免疫学教研室提供，抗CD3、CD4、CD8、CD16、HLA-DR的mAb、CD4 T淋巴细胞绝对计数试剂盒(TruCountTM)以及流式细胞仪（FACSCalibur）均为美国Becton Dick-inson公司产品。HIV-1／2抗体和HIV-1 p24抗原检测试剂均为荷兰Orga-non Teknika公司产品，免疫印迹（WB）试验试剂为新加坡Genelabs Diagnos-tics公司产品。RPMI 1640为GIBCO公司产品，PHA和rIL-2为Sigma公司产品，其它化学试剂均为国产分析纯。 2．研究对象： 34例HIV-1抗体阳性病例均经中国医科大学第一临床学院艾滋病研究室WB试验确认，其中男性26例，女性8例，年龄范围在18-40岁，根据1993年美国CDC制定的艾滋病监测病例分类及扩大的诊断标准，无症状HIV感染（AS）组（CD4+T淋巴细胞妻200个/闪）25例，AIDS组（CD4+T淋巴细胞<200个/川）9例。感染途径包括输血、静脉注毒和性传播。所有外周静脉血均在未接受抗逆转录病毒治疗前采集并保存，EDTA一KZ抗凝。正常对照组为随机抽取的26例健康人，男性16例，女性ro例，年龄范围在1942岁。 二、实验方法 1.cD4+T淋巴细胞绝对计数: 参照美国CDc“HIV感染者cD4+T细胞的检测指导方法〔‘，〕”，采用溶血一免洗法TruCOUNTTM进行FITC/PE/Pe尤P三色荧光标记染色:T加COU-NTTM测试管中，加20闪TriTEsT试剂（CD4/CDS/CD3诚b）和50闪抗凝血，孵育巧而n后再加450闪免洗溶血素，孵育巧一30而n。流式细胞术（FCM）检测和分析:应用M血isET软件进行，得到CD3+T细胞、CD4+T细胞、CDS十T细胞绝对数以及相对比值。 2.淋巴细胞膜表面CD226（mCD226）分子的检测: 采用三荧光染色标记体外培养细胞、HIV感染者以及健康对照的全血细胞，按CD226/CDS/CD3，CD226/CD4/CD3，HLA一DR/CDS/CD3，HLA-DR/CD4/CD3，CD226/CD16/CD3、CD226/CDS/CD3和CD226/CD咚/CD3等mAb组合给试管编号并在管中分别加人一定量的上述mAb;再加人全血80闪或细胞悬液，室温保存30而n;加2一而溶血素，室温保存5一10min至完全溶血;重复洗细胞3次后，加0.5而1%多聚甲醛固定细胞，避光保存，FCM检测与分析。应用CellQuest软件。用前向散射角（FSC）及侧向散射角（SSC）确定淋巴细胞群，再分别以CD3+细胞、CD3·CD16+、CD3一CDS+淋巴细胞为门，分析表达CD226的细胞，以阳性百分率（%）表示，并根据淋巴细胞数计算出特定细胞亚群绝对数（。ells/，）。 3.双抗体夹心EUSA法检测可溶性CD226（sCD226）分子水平: 玩。Al包被EllSA板，过夜。向板中加人标准品CD226/F。融合蛋白和待测样本，孵育45而n，再加人HRP标记的mAb，孵育45min，加人底物TMB显色，2.smoFL HZSO4终止反应。测定OD4s。吸光度（A），以标准品的A值和相应的浓度作标准曲线;将待测样本的A值与标准曲线相比，计算待测样本的sCD226浓度。 4.HIV一1 503体外活化外周血单个核细胞（PBMC）: Hlv一1。。3株和MT4细胞系由中国疾病预防与控制中心参比实验室惠赠。按常规传代并测定感染滴度（TCID50）。分离健康人PBMC，调整细胞浓度后分组用于实验，pBMC与HIV一1 503（125 TCID，）共孵育Zh后，接种于细胞培养板，作为染毒组，设立不染毒或不加PHA的对照组。在不同时间点收集培养细胞进行免疫荧光染色，FCM分析，收集细胞培养上清检测SCD226的浓度，同时测定HIV一1 p24抗原，以确定细胞的病毒感染效果。 5.统计学分析: 用SPSS 10.0软件对实验数据进行分析。t检验进行As/AIDS患者和健康对照组间sCD226、mCD226均值比较。Spe一相关分析sCD226分子水平与CD226+T细胞、CD4+T细胞百分率的相关性。实验结果 一、HIWAIDS患者T淋巴细胞CD226的表达水平 经FCM测定外周血T淋巴细胞及其CD4+T细胞、CDS+T细胞亚群中的CD226抗原表达可见:AS组和AIDS组CD3+T细胞中CD226+细胞百分率为41 .6土31 .4%和47.3土17.2%，明显高于健康对照组22.6*16.7%（p<0 .01）;CD4+T细胞和CDS+T细胞亚群中CD226+细胞百分率均显著高于健康对照（p<0.01），但与CD3+T细胞中的CD226表达水平没有显著差异;CD4+T细胞与CDS+T细胞亚群，AS组与AIDS组CD226+细胞百分率差异均不显著。 二、HIWAIDS患者T淋巴细胞CD226和HLA一DR的表达 CD226+T淋巴细胞百分率在AS组（41 .6士31 .4%）和AIDS组（47.3士17.2%）均显著高于健康对照组（22.6士16.7%），HLA一DR+T淋巴细胞百分率只在AIDS组（44.2土24.1%）与健康对照组（14.1土5.5%）差异显著，AS组（19.7土6.8%）与健康对照无显著差异。 三、人PBMc CD226和HLA一D