一、研究背景乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤。中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一,发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。乳腺癌已经成为城市女性的第一杀手。尽管已对乳腺癌的发病原因进行了大量的研究,但其发生、发展的确切机制仍不十分清楚。硫氧还蛋白系统是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统,与肿瘤的发生发展密切相关。近来硫氧还蛋白系统被认为是肿瘤治疗靶点。硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin interaction protein, TXNIP),又名硫氧还蛋白结合蛋白-2(TRX-binding　protein-2, TBP-2)；维生素D3上调蛋白(Vitamin D3 up-regulated protein 1, VDUP-1),是α-视紫红质抑制蛋白家族成员之一,广泛存在于多种组织中。TXNIP基因位于人染色体1q21-22,包含8个外显子,长4174bp。 TXNIP可以与硫氧还蛋白结合而抑制其抗氧化功能,同时参与调节体内活性氧系统以及线粒体通路的过程,诱导细胞的凋亡程序。Cadenas等通过观察788例淋巴结阴性的乳腺癌患者,发现TXNIP表达患者具有较好的无病进展生存期(HR=0.642; P<0.001)。 TXNIP可以作为乳腺癌患者对蒽环类药物疗效的预测分子。在Her-2过表达的乳腺癌细胞株MCF-7中,TXNIP的表达水平明显下降。因此Her-2介导的TXNIP表达水平的降低可能是其参与Her-2信号通路的一个重要的关键分子。Her家族成员是最早发现的肿瘤分子靶点之一。Her家族包含Her-1、Her-2、Her-3和Her-4四个家族成员。Her家族各成员可以组成同源或是异源二聚体,导致胞内酪氨酸激酶区的活化,进而激活下游Ras/Raf/MAPK 和PI3K/Akt/mTOR信号通路,继而调控细胞增殖和细胞凋亡。目前关于Her-1的靶向药物包括单克隆抗体西妥昔单抗；小分子酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼、厄洛替尼等。关于Her-2的靶向药物包括单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。多项研究发现近一半的三阴性乳腺癌和炎性乳腺癌患者存在Her-1基因过表达的现象,同时约有30%的乳腺癌患者能够过表达Her-2。因此Her家族在乳腺癌中的作用日趋重要。拉帕替尼作为Her-1和Her-2的双重抑制剂,被批准用于联合卡培他滨治疗Her-2过度表达的,既往接受过包括蒽环类、紫杉醇、曲妥珠单抗治疗的晚期或转移性乳腺癌。现已发现拉帕替尼能够阻断Her-1/Her-2,抑制cyclin D1的表达,进而增高p27的表达水平。p27是细胞周期调控机制中最关键的抑制因子,几乎可以抑制所有的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase, CDK)和细胞周期素(cyclin)复合物的激酶活性,在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用。其中p27可以通过抑制G1期相关的cyclin D1-CDK4等的活性,阻碍细胞周期的进展。课题组前期工作中对p27与乳腺癌的发生发展进行了详细的研究,发现p27可以作为乳腺癌患者无病生存(disease-free cancer survival, DFS)的独立预后因素。同时发现拉帕替尼能够增加叉头蛋白03(Forkhead box 03, FOXO3)的表达而增加p27的转录水平。拉帕替尼也能够升高DYRKIB (dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1B)的表达,进而促进p27 Ser10磷酸化而抑制其降解。亚细胞定位是影响p27发挥功能的重要方式,其中p27进入细胞核是其发挥生物活性最重要的前提条件。c-Jun蛋白能与p27在核内相互作用,使p27转移到细胞质,进而促进p27在胞质的泛素化-蛋白酶降解。c-Jun激活区结合蛋白(Jun activation domain-binding protein 1, Jab1)能够与c-Jun蛋白的N-端激活区结合,增加c-Jun对p27的调控作用。多项研究发现TXNIP可抑制Jab1介导的p27核内转出过程,从而稳定p27表达而促使细胞G1/S期阻滞。故推测p27在TXNIP的抗肿瘤作用中发挥着重要作用。miRNA是广泛存在于真核细胞中的单链非编码RNA,具有物种间高度保守性、表达时序性以及组织特异性；能通过与靶miRNA特异性的碱基配对引起靶基因的降解或翻译抑制,是基因转录后表达的关键调控因子。迄今为止已经有几千个miRNA被发现和鉴定,调控着超过30%的编码基因表达。miRNA与靶基因mRNA之间形成极其复杂的调控网络,在肿瘤发生发展及肿瘤治疗中发挥重要作用。多种miRNA可与乳腺癌的发生发展、侵袭转移和多药耐药密切相关。其中miR-375、miR-221和miR-21均与曲妥珠单抗耐药相关,miR-17-5p亦能参与TXNIP的转录后水平调控。然而,与拉帕替尼相关的]miRNA,以及miRNA是否参与]XNIP与Her-1/Her-2之间的相互作用并未相关报道。为此,在本项研究中利用组织芯片着重探讨]XNIP在早期乳腺癌患者的表达水平及与其预后的关系。通过体外多种实验方法探讨TXNIP在抗Her-1/Her-2治疗中的表达水平变化,并通过miRNA芯片检测miR NA及相关靶基因在TXNIP与Her-1/Her-2相互作用中的调控机制,旨在发现TXNIP与Her-1/Her-2的相互作用调控乳腺癌细胞增殖的分子机制,为乳腺癌的预防和治疗提供新的分子靶点和治疗策略。二、材料、方法与结果第一部分TXNIP与Her-1/Her-2信号通路相互作用与乳腺癌总生存期的关系方法：1.分析150例乳腺癌组织中TXNIP的表达水平与乳腺癌患者临床病理特征和总生存期(overall survival, O S)的关系。2.通过免疫组织化学方法检测150例乳腺癌组织和90例癌旁正常组织中TXNIP、p27的表达,并在101例乳腺癌临床标本中进行验证。利用相关统计学方法分析 TXNIP、p27与乳腺癌患者OS的关系,以及TXNIP、p27与Her-2状态之间的关系。同时分析TXN IP和p27之间的相关关系。3.将TXNIP过表达质粒转染到乳腺癌细胞株BT474和SK-BR-3中,采用蛋白印迹法(Western blotting)检测TXNIP 及 p27的表达水平；用激光共聚焦方法检测p27的核内定位情况。通过流式细胞术观察细胞周期和细胞凋亡情况,并利用克隆形成实验检测TXNIP对细胞增殖的影响。用细胞计数法观察拉帕替尼对转染前后的SK-BR-3细胞增殖情况的影响。4.用实时定量PCR (qRT-PCR)和Western blotting检测Her-1单克隆抗体西妥昔单抗、Her-2单克隆抗体曲妥珠单抗和Her-1/Her-2双重抑制剂拉帕替尼处理后的SK-BR-3和BT474细胞中TXNIP及p27的表达水平。利用双荧光素酶实验检测三种药物对TXNIP转录水平的调控。5.采用SPSS13.0软件进行统计学分析,两组组间均数的比较用t检验,多组计量资料组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),实验数据以x±s进行描述,并进行方差齐性检验。独立组间计数资料比较用卡方检验。相关性分析用r相关分析检验。结果：1.在乳腺癌组织芯片样本中,TXNIP的表达水平与乳腺癌患者TNM分期(χ2=4.994,P=0.025)呈显著相关,与年龄(χ2=2.252,P=0.133)、组织学分级(χ2=0.161,P=0.777)、ER状态(χ2=0.261,P=0.610)以及PR状态(χ2=0.651,P=0.420)未见相关。2.与癌旁正常组织相比,TXNIP和p27在乳腺组织中的表达水平显著降低(χ2=42.633,P<0.001)；χ2=9.500,P=0.023)。采用Kaplan-Meier生存曲线分析发现,在乳腺癌患者中,TXNIP和p27高表达水平预示总生存期延长(χ2=6.441,P=0.001；χ2=6.276,P=0.012)。利用相关分析发现,在组织芯片中TXNIP、p27与Her-2的表达均呈负相关(r=-0.334,P<0.001；r=-0.344,P<0.001)；在101例乳腺癌癌组织标本中,TXNIP、p27与Her-2的表达同样均呈负相关(r=-0.422,P<0.001；r=-0.284,P=0.004)。3.Westem blotting结果显示在乳腺癌细胞中导入TXNIP,能够增加p27的蛋白表达水平及核内稳定性。流式细胞术发现TXNIP能够增加BT474口SK-BR-3细胞G1期阻滞(依次为t=-5.385,P=0.006；t=-4.778,P=0.009)和凋亡(依次为t=19.906,P<0.001；t=5.469,P=0.029)。克隆形成实验均提示TXNIP可以抑制BT474和SK-BR-3细胞增殖(t=12.103,P<0.001;t=12.122,P<0.001),并且拉帕替尼能够增加TXNIP对细胞的增殖抑制作用(t=5.511,P=0.004)。4.在西妥昔单抗、曲妥珠单抗和拉帕替尼处理后的BT474细胞中,qRT-PCR显示TXNIP mRNA不同程度升高(t=135.311,P=0.076; t9.825,P=0.063; t=3.222, P=0.084); p27 mRNA不同程度升高(t=14.269,P=0.056;t=11.135,P=0.089; t=4.860,P=0.040)。在三种药物处理的SK-BR-3细胞中,qRT-PCR显示TXNIP mRNA水平不同程度升高(t=328.0,P=0.071; t=8.322,P=0.056;t=5.709,p=0.003);p27 mRNA不同程度升高(t=34.352,P=0.084;t=5.904,P=0.002;t=14.302,P=0.005).Westem blotting结果显示p27、TXNIP的蛋白表达水平均有不同程度的升高。双荧光素酶实验显示三种药物均能显著升高BT474细胞的荧光素酶活性(依次为t=41.617,P=0.001;t=-26.771,P=0.001;t=93.916,P<0.001);SK-BR-3细胞的荧光素酶活性均显著升高(依次为t=18.322,p=0.003;t=12.924,P=0.006;t=9.596,P=0.011)。提示Her-1/Her-2抑制剂能够增加TXNIP的表达水平。第二部分拉帕替尼介导miR-1470调c-Jun参与p27的表达调控机制方法：1.在0.5μM拉帕替尼处理的乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474中,运用qRT-PCR和Western blotting方法检测p27的表达水平；免疫荧光实验检测p27的核内定位情况。2.在0.5μM拉帕替尼处理的乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474中,利用Western blotting检测Her-2信号通路中相关蛋白的表达水平变化。3.收集不同浓度拉帕替尼处理的乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474,使用miRNA芯片技术检测细胞中miRNA的表达水平,并进行数据汇总和功能聚集分析。运用在线软件TargetScan预测芯片筛选出的差异miR NA的靶基因,并通过在线数据库DAVID对靶基因参与的信号通路进行预测。4.采用qRT-PCR方法对筛选出miRN JA表达进行验证,并用Western blotting检测其对应靶基因的蛋白表达水平。5.通过在线软件TargetScan预测筛选出的miRNA在相应靶基因3’-UTR区的结合位点,构建含此结合位点序列的荧光素酶质粒和筛选出的miRNA过表达质粒。利用双荧光素酶实验、qRT-PCR和Western blotting方法验证筛选出的niRNA对其靶基因的调控作用。并结合流式细胞术检测该miRNA对细胞周期及细胞凋亡的影响。6.采用SPSS13.0软件进行统计学分析,两组组间均数的比较用t检验,并进行方差齐性检验。多组计量资料组间比较用单因素方差分析(one-way ANO VA),实验数据以x±s进行描述,并进行方差齐性检验。结果：1. qRT-PCR和 Western blotting结果显示拉帕替尼处理后的SK-BR-3和BT474细胞中,p27 mRNA的表达水平显著升高(t=21.238,P=0.002；t=24.497,P=0.002)。SK-BR-3细胞中p27蛋白的表达水平显著升高(t=-5.972,P=0.004)；BT474细胞中p27的表达水平亦显著升高(t=-1.943,P=0.124)。免疫荧光实验发现拉帕替尼处理后细胞中p27的核内表达水平增加,提示拉帕替尼能够增加乳腺癌细胞中p27的表达。2.在拉帕替尼处理的SK-BR-3和BT474细胞中,Her-2、p-Her-2、p38MAPK、p-p38 MAPK、p44/42MAPK、p-p44/42MAPK的蛋白表达水平均降低,提示拉帕替尼能够抑制Her家族的下游信号通路。3. miRNA芯片结果显示,拉帕替尼可以改变乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的miRNA表达谱。经过数据汇总,发现在两种细胞株中,0.5μM拉帕替尼能够上调7个miRNA: miR-219-1-3p、miR-126、miR-26A-1*、miR-1470、miR-126*、miR-1908-p和miR-1208。在线软件T argetScan和在线数据库DAVID预测结果提示拉帕替尼上调的三个niRNA:miR-1470、miR-126和miR-1208,能够参与ErbB信号通路。4. qRT-PC证明拉帕替尼上调SK-BR-3细胞中miR-1470、miR-126和miR-1208的表达(分别为t=19.118,P=0.003；t=38.645,P=0.001；t=27.411,P=0.001)。拉帕替尼上调BT474细胞中niR-1470、miR-126和miR-1208的表达(分别为t=36.647,P=0.001; t=39.172, P=0.001; t=25.076, P=0.002)。 Western blotting显示拉帕替尼能够下调miR-1470对应的靶基因c-Jun及p-c-Ju n的蛋白表达水平；miR-126和miR-1208对应的靶基因Crk和Src的表达反而升高,故接下来选择验证miR-1470对c-Jun的调控关系。5.利用TargetScan预测得到,miR-1470在c-Jun mRNA的3’-UTR端存在一个结合位点。在不同种属间,此结合位点序列具有较高的保守性。构建含miR-1470于c-Jun mRNA的3’-UTR区的结合位点序列的荧光素酶质粒。将nc-miRNA、miR-1470minics分别和pmirGLO质粒、β-gal基因转染入SK-BR-3和BT474细胞中,发现转染含野生型质粒的细胞中,上调miR-1470能够显著降低荧光素酶的活性(分别为t=7.059,P=0.009;t=13.093, P=0.006)。在转染含突变型质粒的SK-BR-3和BT474细胞中,提高miR-1470表达能降低荧光素酶的活性(分别为t=11.981,P=0.076；t=9.786,P=0.052)。 qRT-PCI及Western blotting实验证明miR-1470靶向c-Jun,降低cyclin D1的表达,进而促进p27依赖的SK-BR-3和BT474细胞周期阻滞(t=-4.019,P=0.051；r=-3.572, P=0.003)。三、结论与意义1. TXNIP在乳腺癌组织中呈低表达,并与Her-2状态呈负相关。TXN IP的表达与乳腺癌患者TNM分期显著相关；TXNIP高表达水平预示总生存期延长。2. TXNIP可在体外促进乳腺癌细胞的G1期阻滞和细胞凋亡,并抑制细胞的增殖。3. Her-1/Her-2抑制剂能够在体外增加TXNIP的表达水平。4. Her-1/Her-2双靶点酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼能在体外增加p27的表达,抑带Her家族下游信号通路Her-2、p-Her-2、p38MAPK、p-p38MAPK、p44/42MAPK、p-p44/42MAPK蛋白的表达水平。5. miRNA芯片发现拉帕替尼能够上调参与ErbB信号通路的miR-1470、miR-126和miR-1208的表达。其中miR-1470通过靶向c-Jun,促进p27依赖的细胞周期阻滞,抑制乳腺癌细胞的增殖。6.本实验揭示了TXNIP能够与p27相互作用,进而影响Her-1/Her-2信号通路,在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用,并可能与乳腺癌患者抗Her-1/Her-2治疗相关。