siRNA沉默CTGF表达对退变软骨终板细胞基质合成及凋亡的影响

来源 :内蒙古医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mark_johnson
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目的:通过基因干扰技术即RNAi(RNA interference)诱导软骨终板细胞结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因沉默,研究其对软骨终板细胞生长活性、基质合成及凋亡等生物学特征的影响。  方法:体外分离、培养大鼠腰椎软骨终板细胞并鉴定,传代至二代后,施加无血清培养基,建立二代软骨终板细胞退变模型;实验同时进行针对CTGF基因的siRNA及短发夹RNA(shRNA)的设计、合成,以及CTGF siRNA表达质粒构建、鉴定、筛选。实验组施加脂质体介导的CTGF siRNA表达质粒转染退变软骨终板细胞;阴性对照组只施加脂质体;空白对照组不做处理;于转染后48h收集细胞,通过Real-time PCR和Western blot法检测CTGF mRNA和CTGF蛋白的表达水平,检测转染抑制效果;采用MTT法检测细胞的生长活性,绘制细胞生长曲线,通过Real-time PCR法检测collgenⅡ、aggrecan表达情况,Western blot法检测转染后Fas蛋白表达水平。  结果:体外成功分离、培养了大鼠腰椎软骨终板细胞,经过鉴定证实为软骨终板细胞;设计合成的CTGF siRNA重组表达质粒经脂质体介导成功转染入退变的软骨终板细胞,并通过Real-time PCR和Western blot检验证实CTGF mRNA和CTGF蛋白的表达水平明显下调,差异均有显著性(P<0.05);当CTGF被抑制的同时,退变软骨终板细胞的生长受到了抑制,collgenⅡ、aggrecan的表达量分别下降到了被抑制前的40%和33%,而Fas蛋白的表达水平明显增加,差异均有显著性(P<0.05)。  结论:1.CTGF基因下调可抑制退变软骨终板细胞生长活性,降低细胞外基质collgenⅡ、aggrecan的表达。2.CTGF可抑制退变软骨终板细胞的凋亡。
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