由腐生型真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的小麦纹枯病,已成为我国最严重的真菌病害之一。小麦纹枯病抗性遗传基础研究薄弱,易于育种利用的抗纹枯病小麦种质资源匮乏,迫切需要揭示抗纹枯病作用机制、发掘抗纹枯病有效基因。大量的研究已表明ERF转录因子在植物防御反应中起着重要的调控作用。本课题组在前期工作中,从抗多种病害的小麦近缘野生种中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)中,分离到一个受纹枯病菌诱导的乙烯反应因子(ERF)基因TiERF1,并将其转入小麦品种扬麦12号中。本研究对TiERF1转录因子的特性与功能进行了更深入的研究。Southern杂交分析表明TiERF1基因在中间偃麦草基因组中至少含有两个拷贝。酵母单杂交试验结果表明,其编码的TiERF1蛋白能够在酵母体内与GCC-box顺式作用元件结合,并激活下游报告基因的表达,当预测的转录激活域缺失后,TiERF1的转录激活活性基本丧失。对转TiERF1基因小麦进行的PCR扩增和Southern杂交分析表明：TiERF1基因已成功整合入转基因小麦基因组中,并能够稳定遗传。定量RT-PCR分析结果表明,TiERF1基因能够在稳定遗传的转基因小麦株系中过量表达,并且一些乙烯/茉莉酸抗病信号途径上的病程相关基因几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因等的表达水平也显著提高。纹枯病抗性鉴定结果表明,与未转基因的小麦受体扬麦12号和TiERF1基因表达沉默的小麦株系相比,TiERF1基因的过量表达使转基因小麦对纹枯病的抗性得到提高。可以初步推测：TiERF1基因的转录调控机理是通过结合一些ET/JA信号转导途径中防御相关基因启动子上GCC-box顺式作用元件,激活这些基因的转录表达,从而介导寄主对纹枯病菌的防御反应。本研究对于揭示小麦抗纹枯病作用机制、改良小麦品种的纹枯病抗性非常重要。小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(BYDV)侵染引起的小麦主要病毒病害之一。至今,小麦属内尚未发现有效的抗黄矮病基因。小麦的近缘野生种中间偃麦草7X(7Ai#1)染色体长臂上的抗黄矮病基因Bdv2,高抗BYDV多个株系。本课题组已将携带Bdv2的中间偃麦草7Ai#1染色体长臂片段导入普通小麦基因组,选育出抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642等。由于该易位的外源染色体片段可能携带不利性状,因此分离7Ai#1L染色体上的抗黄矮病重要基因,对于深入研究抗黄矮病作用分子机制,开展抗黄矮病小麦基因工程育种十分重要。本课题组在前期研究中利用比较作图等策略,筛选出一些定位于含Bdv2的中间偃麦草染色体7Ai#1L区的基因表达序列EST-PCR标记。其中一条特异序列与蛋白激酶具有较高的同源性。本研究以上述含Bdv2的7Ai#1L区特异的蛋白激酶基因序列做为起始序列,开展了以下研究,取得良好进展。(1)首先利用瞬时的病毒诱导的基因沉默技术使抗黄矮病的小麦易位系YW642中该蛋白激酶基因表达沉默,结果此材料对黄矮病表现感病,表明该蛋白激酶基因是中间偃麦草染色体7Ai#1L区上的抗黄矮病重要基因。(2)利用RT-PCR和RACE方法,从接种饲BYDV蚜虫的中间偃麦草中,分离到该基因的全长序列。序列分析得知,该基因编码一个催化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸化的双底物特异性蛋白激酶,因此,命名该基因为TiDPK1 (Thinopyrum intermedium Dual-specificity Protein Kinase 1)。TiDPK1基因的编码产物具有类受体蛋白激酶(RLK)的结构特征,即含有一个胞外结构域、一个跨膜结构域及一个位于细胞质的蛋白激酶催化结构域。(3)通过自磷酸化试验证实TiDPK1蛋白的激酶催化结构域具有较强的自磷酸化活性。(4)通过基因枪转化洋葱表皮细胞瞬时表达试验表明TiDPK1-GFP融合蛋白集中分布于细胞膜。(5)Southern杂交分析表明TiDPK1基因定位于含Bdv2的中间偃麦草染色体7Ai#1L区,但在小麦与中间偃麦草基因组中都有同源拷贝,说明该基因是基因家族的一个成员。(6)对TiDPK1基因的表达特性分析结果表明：该基因仅在含Bdv2的抗黄矮病材料中表达,受BYDV诱导而上调表达,并且在接种BYDV的12h达到表达高峰；TiDPK1基因的表达在未接种BYDV的YW642幼苗期的各组织中无明显差异,但在接种BYDV约40天的YW642成株期的组织中具有表达优势,其中以叶片表达量最高,这似乎与抗黄矮病的功能相关,成株期时小麦黄矮病主要在叶部发病,TiDPK1基因的转录本优势地出现在叶片中,而小麦茎秆韧皮部可能是BYDV传输的主要部位,因此茎秆中TiDPK1基因表达量也较根和幼穗中高。此外,外源激素油菜素内酯和水杨酸处理可以明显提高TiDPK1基因的表达量。(7)利用酵母双杂交系统验证了TiDPK1蛋白激酶的胞外结构域与BYDV外壳蛋白的相互作用。(8)利用转基因技术从功能获得方面(使TiDPK1基因在感黄矮病小麦中表达)和功能缺失方面(利用双链RNA干扰技术敲减TiDPK1基因在抗黄矮病小麦中的转录本)开展该基因的功能互补研究。结果表明,受体小麦中8601对黄矮病高度敏感,TiDPK1基因表达的转基因小麦获得了对黄矮病的抗性,与携带Bdv2的抗黄矮病对照小麦易位系YW642对黄矮病的抗性程度相当；另一方面,以携带Bdv2的抗黄矮病小麦易位系YW642做受体,获得的TiDPK1基因沉默的转基因小麦对黄矮病表现高度敏感,与感黄矮病对照中8601相当,充分说明TiDPK1是中间偃麦草7Ai#1L染色体上的抗黄矮病重要基因。