雷公藤(Tripterygium wifordii Hook.f.)又名断肠草、黄藤木等,是卫矛科(Celastraceae)雷公藤属(Tripterygium)植物。产于福建、湖南、浙江等地。雷公藤性温、味微苦。在我国传统中医药中,雷公藤的使用有着悠久的历史,主要用于治疗水肿、炎症、溃疡、发热等症状。雷公藤制剂最初是用来治疗炎症和类风湿性关节,后来才用于肿瘤、慢性间质性肾炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎以及各种皮肤病的治疗。尽管雷公藤临床疗效确切,但其严重的毒副作用在很大程度上限制了其在临床上的广泛应用,特别是能在治疗范围内出现肝脏损伤。对雷公藤的肝毒性到目前为止主要集中研究雷公藤甲素,其他成分或组分研究的相对较少,究竟哪些成分、组分会产生肝毒性,到目前为至都还不清楚。为保障患者使用雷公藤的安全,最大限度的发挥该药治疗多种疾病的优势。我们对雷公藤提取物的肝毒性成分及效应成分进行了研究,以期发现雷公藤中肝毒性成分及抗炎与免疫抑制成分。本研究采用长时间给药后的毒性研究和成分分析方法,观察雷公藤不同提取部位动物给药后不同时间点各类成分在动物体肝脏的分布和蓄积情况,选择毒性反应较大的部位作用后的小鼠肝脏进行分析,获得亲和力高,蓄积作用强的成分信息,作为潜在毒性成分;利用细胞亲和作用,分析雷公藤成分与毒性靶部位肝细胞和效应靶部位脾细胞以及巨噬细胞相互作用的情况,并进行比较,获得相应的亲和作用成分,试图研究确定对肝脏毒性低而免疫抑制活性高的成分。本文旨在阐明雷公藤中肝毒性及效应成分物质基础,为雷公藤的低毒高效成分/成分群的研究提供新的思路与方法。本研究主要包括以下内容:1.雷公藤中肝毒性物质存在部位的确定。采用系统溶剂法分离得到雷公藤不同提取部位(醇提部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提部位)。ICR小鼠,雌雄各半,给予雷公藤这四个部位,分为空白组、醇提高、低剂量组;乙酸乙酯高、低剂量组;正丁醇高、低剂量组;水提高、低剂量组。低剂量组为临床等效量,相当于3.25g生药/kg,高剂量组为临床等效量的5倍,相当于16.25g生药/kg,空白组给以等体积的生理盐水。有1、2、3、4周共4个时间,每个时间点有9个实验组。分别于第1周、第2周、第3周、第4周末次给药后12h取血及肝脏,测定血清中AST、ALT、LDH、ALB、TP的含量,并做组织病理切片,光镜下观察肝脏变化的情况。实验结果显示雷公藤醇提部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提部位均具有肝毒性,且醇提部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的毒性较大,水提部位对肝脏的毒性较小。2.雷公藤中单体化合物的分离鉴定及对肝细胞的毒性作用。采用硅胶柱色谱法对毒性较大的乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行成分的分离,应用结晶紫染色法,通过人正常肝细胞(L-02)对分离得到的成分进行毒性筛选,找出肝毒性成分。实验结果显示,从乙酸乙酯部位分离到3种化合物,分别为原花青素B、儿茶素、表儿茶素,从正丁醇部位分离得到蔗糖和纤维二糖混合物,这些成分对L-02细胞没有明显的毒性作用。3.雷公藤中肝毒性蓄积成分的分析取雷公藤95%醇提物高剂量(16.25 g生药/kg)给药10天的小鼠及空白对照小鼠,分别取其肝脏,制成匀浆,另取空白鼠的肝脏匀浆后加入雷公藤醇提物水溶液(16.25g生药/kg)。三份肝匀浆各自平均分为两份,分别用乙酸乙酯和二氯甲烷萃取,另外一份作为空白对照。取有机溶剂层并挥干溶剂,再用95%甲醇溶解,制成共6份样品,对脏器亲和成分进行液质联用分析,获得相应的亲和作用成分。实验结果显示,tridioltonide、epigallocatechin、triptoquinoneH、triptobenzeneN、triptininB、triptoquinoneE、13-epi-19-nor-manoyloxide-18-oic acid、(+)-isolariciresinol、triptoquinoneC、(+)-dehydroabietane、triptolide、triptocallol、山海棠二萜内酯A、雷酚萜酸J是潜在的肝毒性成分。4.雷公藤中低肝毒性的免疫抑制活性成分的分析。采用原代分离大鼠巨噬细胞、小鼠脾细胞和肝细胞,用RPMI-1640培养基制成混悬液接种于24孔板中,细胞浓度1-2X106个,置于5%C02,37℃及饱和湿度条件下培养1h,加入雷公藤醇提物水提液,浓度为2g/ml,继续培养0.5h,取细胞上清液,运用液质联用技术分析肝细胞与脾细胞和巨噬细胞结合成分的差异。实验结果显示,雷酚萜醇、雷酚内酯 triptonodiol、wilforolF、triptobenzeneL、triptoquinoneG、(-)-syringaresinol、triptoquinoneC、triptocallol、dibutylphthalate、triptobenzene A、triptoquinone D、triptobenzene M、12,14-Dihydroxy-3-oxo-abieta-8,11,13-triene、11-hydroxy-14-methoxyl-dehydrobaietane、methoxyl-dehydrobaietan可能是对肝脏影响较小的免疫活性成分。5.不同种属动物考察雷公藤的肝毒性选用SD大鼠288只,雌雄各半,给予雷公藤75%醇提物水溶液。按体重随机分为低剂量组(临床等效量组:2.25 g生药/kg),中剂量组(2.5倍量组:5.625 g生药/kg),高剂量组(5倍量组:11.25 g生药/kg),空白组(生理盐水)。每个时间点包括4个试验组,每个组共设大鼠12只,雌雄各半。每天灌胃一次,于给药后于1、2、3、4、6、8周共6个时间点采血,取肝脏。检测血清中ALT、AST、TP、ALB的含量,并作肝组织病理切片,光镜下观察肝脏变化的情况。实验结果表明,雷公藤提取物从第二周开始对大鼠的肝脏产生明显的毒性。