研究背景:　　 越来越多的研究证实,血液系统肿瘤和部分实体瘤中存在着一群成瘤能力特别强,分化程度极低的细胞,称为“肿瘤干细胞”(cancer stem cells,CSCc)或“肿瘤启动细胞”(tumor-initiating cells,T-ICs)(1-4)。目前的研究证实乳腺癌中也存在着乳腺癌干细胞。利用特异性的标记物Lin-ESA+CD44+CD24-/弱阳性(5)或ALDH1(6)分选出的人乳腺癌细胞具有自我更新、多向分化的潜能,数目极少就能成瘤,类似于正常的干细胞；鼠来源的单个的LA7乳腺癌细胞能在体外形成具有腺管和腺泡样结构的腺管树,并能在NOD-SCID鼠中形成肿瘤(7)；在我们课题组既往的研究中证实,从人乳腺癌细胞株和原代人乳腺癌细胞中能分离出具有干细胞样特性的乳腺癌细胞(8)。而且,体内外研究发现乳腺癌干细胞对各种治疗耐受。化疗是治疗乳腺癌的重要手段,乳腺癌干细胞对阿霉素和顺铂等多种化疗药物耐受,临床治疗过程中有相当部分的患者在化疗后甚至化疗期间出现肿瘤的复发和转移,且化疗后富集的乳腺癌细胞特异性高表达CD44+/CD24-,具有干细胞样特性(8)。以上的研究结果提示很可能是残存的乳腺癌干细胞对化疗耐受,尽管消灭了非肿瘤干细胞导致了疾病的缓解,但是如果没有清除肿瘤干细胞,肿瘤仍旧会复发。因此,肿瘤干细胞不仅仅是肿瘤的起源,也是肿瘤对治疗耐受,继而出现疾病进展(3)、复发(9)、转移(3)的重要因为。　　 多种人类肿瘤存在自噬活性的改变。通常所说的自噬(autophagy),是指巨自噬(Macroautophagy),是高等和低等动物中均存在的高度保守的溶酶体分解代谢细胞内蛋白和细胞器的过程。自噬在不同肿瘤或同一肿瘤的不同阶段发挥不同的作用。因此,autophagy对细胞的作用具有两面性,可以说是一把双刃剑,既可以作为细胞生长的“朋友”,也可能成为“敌人”(10-12)。迄今为止,自吞噬在肿瘤干细胞研究领域中的作用仍旧是空白,自吞噬作用是促进了还是抑制了乳腺癌干细胞的生存不清楚。对肿瘤干细胞自噬特性的研究,对深入理解肿瘤干细胞乃至整个肿瘤的生物学特性具有极其重要的意义,将有助于更加清晰的理解肿瘤的发生、发展机制,为乳腺癌的治疗提供新的靶标和新的思路。　　 研究目的:　　 1.利用CellSearchTM System自动化、标准化定量检测、纯化和富集乳腺癌患者外周血循环的肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),从功能和分子标记物方面证明CTCs具有肿瘤干细胞样的特性,建立新型的体内外富集乳腺癌干细胞的生物学模型。　　 2.乳腺癌干细胞的自吞噬水平。　　 3.乳腺癌干细胞自吞噬作用的调控机制。　　 研究方法:　　 围绕上述研究目的,本研究采用以下方法:利用CellSearchTM System富集人乳腺癌患者外周血中循环的肿瘤细胞(CTCs),利用悬浮培养体系富集原代和细胞株来源的球囊细胞,通过体内外研究,从生物学功能和分子标记物方面证明CTCs和球囊细胞具有肿瘤干细胞样的特性。　　 将具有肿瘤干细胞样特性的CTCs和球囊细胞置于无血清、无氨基酸的培养基(EBSS)中,建立饥饿模型诱导自噬(autophagy),并同时应用溶酶体抑制剂Bafilomycin Al(Baf-Al)阻断自噬体(autophagsome)与溶酶体(lysome)的融合,阻断自噬发生过程(autophagic flux),通过免疫蛋白印记技术(western-blot)检测乳腺癌干细胞(失巢生长的CTCs和球囊细胞)与非乳腺癌干细胞(在巢生长的原代肿瘤细胞和贴壁细胞)中LC3-Ⅱ的蛋白水平表达变化,利用免疫荧光技术,结合共聚焦显微镜技术定量检测转染了GFP-LC3融合蛋白的MCF7球囊细胞和贴壁细胞中的LC3 dots(autophagysome),比较乳腺癌干细胞和非干细胞的基础自吞噬水平以及饥饿条件下的自吞噬水平的变化。　　 利用real—time PCR,western-blot检测肿瘤干细胞参与调控autophagy的相关信号通路:Beclinl/PI3K classⅢ和mTOR依赖的信号通路的激活情况。利用PI3K的抑制剂wortminne和3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制PI3K ClassⅢ的活性,观察饥饿条件下LC3-Ⅱ的表达变化。应用Beclinl turn on-off质粒转染MCF7细胞(MCF7/Beclinl),western-blot确认Tetracyclin处理后,MCF7/Beclinl细胞Beclinl的表达关闭,再进一步观察关闭Beclinl表达后MCF7球囊细胞在饥饿条件下自吞噬水平的变化。利用Rapamycin阻断mTOR通路的激活,观察MCF7球囊细胞在饥饿条件下自吞噬水平的变化。　　 研究结果:　　 1.CellSearchTM System能富集高纯度人乳腺癌外周血循环的肿瘤细胞(CTCs,),CTCs高表达CD44+/CD24-和ALDH1+,并具有自我更新功能。　　 2.原代来源和细胞株来源的球囊细胞具有自我更新能力,高表达CD44+/CD24-和ALDH1+,强大的体内成瘤能力,具有乳腺癌干细胞样特性。　　 3.与非乳腺癌干细胞相比,乳腺癌干细胞具有更高的基础自噬水平。　　 4.饥饿状态下,乳腺癌干细胞具有更高的自噬水平。　　 5.Beclinl/PI3K classⅢ和mTOR信号通路参与调节了乳腺癌干细胞的自噬水平。Beclinl/PI3K ClassⅢ在乳腺癌干细胞早期自吞噬的诱导中发挥重要作用,长时间的保持高自吞噬活性与mTOR通路的调节相关。　　 研究结论:　　 1.人乳腺癌外周血循环的肿瘤细胞和球囊细胞中富集乳腺癌干细胞样特性的肿瘤细胞。　　 2.乳腺癌干细胞比非乳腺癌干细胞具有更高的自吞噬水平。　　 3.Beclinl/PI3K ClassⅢ和mTOR信号通路均参与调控了乳腺癌干细胞的自噬作用。