论文部分内容阅读
随着家禽养殖业的迅速发展,禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)病导致的发病率和死亡率随之增加,对家禽养殖业带来严重经济损失。同时,研究表明,APEC作为人类肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic E.coli,Ex PEC)的毒力基因库,被认为是人源肠道外致病性大肠杆菌有密切关系,并对人类健康构成严重的间接威胁。因此,加强对APEC的预防和控制具有重要的公共卫生学意义。大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)作为APEC中新发现的可能导致APEC致病性的毒力基因簇,近年来,对它的研究大都停留在流行病学上面,但对ETT2是否分泌效应蛋白及其具体致病能力尚不明确。基于实验室前期研究基础,转录调节子在控制细菌细胞的生命中起着至关重要的作用,可通过多种途径对APEC的致病性产生影响。但ETT2中转录调节子是否有同样的功能还未可知。本课题从ETT2中etr A基因入手,通过生物信息学分析其理化性质及功能,构建APEC中etr A基因缺失株和回复株,评价其对APEC生物学特性的影响,采用RNA-Seq技术筛选缺失株表达差异显著的基因,发掘APEC潜在的毒力因子,梳理其可能的致病机制。最后,对其蛋白进行原核表达及验证,为后期寻找下游靶基因,进一步研究EtrA调控APEC对宿主致病性的影响提供理论依据。本研究主要的研究内容和结果总结如下:1.EtrA的生物信息学分析及基因缺失株与回复株的构建从NCBI数据库中检索Escherichia coli O157:H7 str.Sakai DNA(Gen Bank:BA000007.3)ETT2中EtrA的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明EtrA为酸性亲水性蛋白,分子中不存在跨膜结构和信号肽序列,含有2个磷酸化位点,EtrA蛋白二级结构中组成最多的是α-螺旋占50.00%。三级结构的预测结果与二级结构预测一致。对其相互作用蛋白的拓扑网络预测发现,EtrA属于响应调节剂Lux R/Fix J操纵子家族成员,是一类在革兰氏阴性细菌群体感应中起重要作用的调控蛋白。通过PCR检测,证明临床分离株APEC 40菌株含有目的基因etr A。氨苄青霉素和氯霉素筛选结果表明可以利用Red两步同源重组的方法构建APEC-etr A基因缺失株,同时,利用酶切特性将p STV28质粒和扩增出含酶切位点的etr A片段用T4连接酶进行连接化转入APEC40-Δetr A中,得到etr A基因回复株APEC40-CΔetr A。2.etr A基因的生物学特性评价及转录组学分析验证本课题首先研究了APEC40野生株、基因缺失株APEC40-Δetr A和回复株APEC40-CΔetr A在运动及生物被膜形成能力方面的差异。研究发现,缺失株、回复株同野生株相比,在LB培养基中的生长性能无明显差异(P>0.05);与野生型APEC40相比,etr A基因缺失会造成APEC40菌株运动性降低(P<0.01)且在一定程度上会影响细菌生物被膜的形成能力(P<0.001),药敏试验表明,etr A的缺失导致对氨苄青霉素的敏感性由敏感变成中介。基于前期研究中etr A对生物被膜和运动性的影响,进行转录组学和荧光定量PCR验证。结果显示两个转录本共获得176个差异表达基因,其中上调基因124个,下调基因52个。转录组学GO功能分析差异表达基因主要涉及细菌生理代谢、细胞过程、毒力、压力应激、结合及催化活性和生物学调控等31个生物学过程中,KEGG富集分析显示差异表达基因主要集中在环境信息处理、代谢、膜运输、信号传导通路中。荧光定量PCR验证结果确定所选基因的表达水平与转录组学差异基因结果基本一致。由此可以确定转录组学分析结果的可靠性。基于转录组学结果,etr A基因不仅影响了菌体运动及生物被膜形成能力,差异表达基因主要涉及细菌生理代谢、毒力、压力应激和生物学调控等生物学过程,对etr A基因的其他生物学特性进行表型试验验证,抗逆性试验中,野生型APEC40和APEC40-Δetr A缺失株在高渗透压和酸性环境下存在显著差异(P<0.001),而在过氧化氢应激下无显著差异。体外血清敏感性试验检测结果表明,当血清含量为70%以上时,缺失株APEC40-Δetr A对血清的敏感性显著高于野生株APEC40(P<0.001)。溶血性试验结果表明etr A基因缺失后的溶血能力与野生株无显著差异。3.禽大肠杆菌ETT2-EtrA蛋白的原核表达及验证分别设计出2对引物;利用PCR扩增出etr A基因的抗原表位富集区序列,并分别克隆至p ET32a和p Creat S—II表达载体中。通过PCR和酶切分析,分别获得含有相应基因的重组质粒。将获得的重组质粒转化至BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。经过SDS-PAGE以及Westem-Blot分析后,2个融合蛋白大小位置分别为37.37 KD和33.4 KD,获得的2个融合蛋白分别命名为p ET32a-EtrA蛋白和p Creat S—II-EtrA,为后期预测EtrA蛋白的调控机制及作用提供了研究基础。综上所述,本研究通过生物信息学分析出EtrA为转录调节子,并成功构建etr A基因缺失株和回复株,缺失etr A基因后,对菌株生长性能、溶血能力及抗氧化应激能力无显著差异,细菌运动能力、耐酸性和抗血清敏感能力降低,生物被膜形成能力和抗渗透压显著增强。RNA-Seq技术显示etr A基因影响菌体代谢、生物被膜、外膜蛋白和抗逆基因等的转录水平,以上基因均与细菌致病性相关。表明etr A参与调控APEC生物表型和致病作用,其可能通过调控菌体代谢、生物被膜、外膜蛋白和抗逆基因的表达进而影响APEC致病过程。