论文部分内容阅读
目的：胸主动脉夹层(thoracic acute dissection, TAD)重危害人类生命健康,其起病急,预后差。随着诊疗技术的不断提高,TAD的诊出率逐年提高,临床资料统计其发病率约为3-6/100000。在保守治疗下,50-68%的TAD患者在发病后48小时内死亡,并且随病程进展死亡率呈上升趋势。目前治疗TAD的方法主要是胸部开放手术及微创下腔内隔绝术,但开放手术时间长、术中操作复杂,术后并发症较多,腔内隔绝术适应证较窄,因此有必要从TAD的发病原因及机制方面探究预防及治疗TAD的新的方法,更好地改善患者的预后。许多研究表明血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的生物学功能异常参与了TAD的发生与发展,其中VSMC的表型转换是关注的热点。VSMC存在两种表型,一种是收缩型(分化型),特点是其调节血管壁张力及维持弹性能力强,增殖、迁移功能差,一种是分泌型(去分化型),特点是其增殖、迁移能力强,维持血管壁力学属性能力差。正常状态下,VSMC主要以收缩型存在,但在比如TAD等病理条件下,VSMC则主要以分泌型存在,这种现象提示我们VSMC的表型转换可能与TAD的发生发展有相关性。已有大量文献证实TGF-β1/Smad信号通路参与生物体内众多生理病理过程,包括细胞分化、增殖及凋亡,相关研究表明TGF-β1/Smad信号通路参与VSMC的功能异常过程。TGF-β1/Smad信号通路无法直接将信号传导至细胞核内,其必须与一些转录因子结合发挥作用。Nanog被证实是维持胚胎干细胞增殖性的重要因子,并且受到Smad2的直接调控,但关于Nanog是否可以维持VSMC的增殖性(分泌型)参与TAD的发病未见报道。本研究目的是明确TGF-β1/Smad信号通路是否通过调控Nanog促进VSMC的表型转换从而诱导TAD的发病。方法：本研究分为以下三部分。1、收集TAD患者主动脉壁组织标本(13例)与无主动脉疾病尸检或捐赠者的主动脉壁组织标本(10例),利用RT-PCR、WesternBlot实验技术在mRNA及蛋白水平检测TGF-β1、Smad、Nanog及相关信号因子在正常与病变血管壁组织中的表达有无差异,利用免疫组织化学染色技术对比正常主动脉组织和TAD主动脉组织中TGF-β1、Smad、Nanog及相关信号因子表达量和表达部位的差异。2、收集无主动脉疾病尸检病人的新鲜主动脉组织,培养中膜层VSMC。用]TGF-β1细胞因子刺激VSMC,以同株人VSMC作对照,采用RT-PCR及Western Blot技术对比TGF-β1细胞因子刺激组和空白对照组中Smad2、Smad3及α-SMA的mRNA及蛋白表达差异。3、收集无主动脉疾病尸检病人的新鲜主动脉组织,培养中膜层VSMC。用TGF-β细胞因子刺激VSMC,以同株人VSMC作对照,采用RT-PCR及Western Blot技术对比两类细胞中Nanog及α-SMA的mRNA及蛋白表达差异；然后以SiRNA干扰VSMC (TGF-β1细胞因子刺激组)中Nanog基因的表达,采用RT-PCR及Western Blot技术验证干扰Nanog前后VSMC中a-SMA的表达量差异；采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, CHIP)技术验证Smad2是否直接结合Nano g启动子区。结果：1、主动脉组织中TGF-β1、Smad、Nanog及相关信号因子的表达情况：RT-PCR结果表明,TAD组主动脉壁组织中TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2、Smad3、 Smad4、Nanog的mRNA表达水平均高于正常对照组(p<0.05)。Western Blot结果显示,TGF-β1、TGFβ-R1、Smad2、Smad3、Smad4、Nanog蛋白在TAD中表达水平高于正常对照组(P<0.05)。免疫组织化学染色表明TAD主动脉组织中TGF-β1、 TGFβ-R1、Smad2、Smad3、Smad4、Nanog的信号强于正常对照组(P<0.05)。2、TGF-β1、Smad、VSMC表型转换的关系：TGF-β1细胞因子刺激人原代主动脉VSMC后,Smad2、Smad3较空白组表达量上调(P<0.05),α-SMA表达较空白组下降(P<0.05)。3、Smad2调控Nanog促进VSM C表型转换的研究：人原代主动脉VSMC加入TGF-β1细胞因子后,Nanog表达量较空白组上调(P<0.05),α-SMA表达量较空白组下降(P<0.05),然后利用SiRNA干扰Nanog后,α-SMA表达量上升(P<0.05); CHIP实验结果表明Smad2结合于Nanog启动子区-298bp到-80bp之间。结论：1、TGF-β1、Smad、Nanog及相关信号因子在TAD组表达量高于正常对照组,提示其与TAD的发生发展具有相关性。2、TGF-β1细胞因子刺激人原代主动脉VSMC后Smad2及Smad3 mRNA表达量上升、α-SMA mRNA表达量下降,提示TGF-β1、Smad2、Smad3参与VSMC的表型转换。3、TGF-β1细胞因子刺激人原代主动脉VSMC后Nanog表达量上升,α-SMA表达量下降,SiRNA沉默Nanog表达后a-SMA表达量再次上升,结合CHIP实验提示TGF-β1/Smad通路通过直接调控Nanog促进VSMC的表型转换参与TAD的发病过程。