目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma)是一种高死亡率的原发性肿瘤。其恶性程度和致死率居高不下,每年大约有25~100万肝癌患者死亡,其预后不良的主要原因主要是肝癌的复发和转移。肝癌肿瘤相关成纤维细胞是肝癌肿瘤微环境的重要成分之一,与肝癌的侵袭和转移密切相关。因此,本研究的目的是探究肝癌肿瘤相关成纤维细胞通过哪些调控机制来促进肝癌侵袭转移。方法:1、收集肝细胞肝癌组织样本和癌旁组织样本提取成纤维细胞,分离并鉴定提取的两种成纤维细胞。分析CAF和PTF间质细胞标志物α-SMA和Vimentin的表达趋势,比较CAF和PTF自身的迁移能力和增殖活性。2、采用NOD/SCID鼠建立皮下瘤模型,初步验证CAF和PTF对肝癌细胞皮下成瘤和肺转移能力的作用,并对预后进行分析。采用Transwell小室迁移、侵袭实验、划痕实验、蛋白印迹实验从体外比较CAF和PTF对肝癌细胞迁移和侵袭、上皮间质转化的作用。3、蛋白芯片检测CAF和PTF分泌蛋白的差异并用Elisa验证蛋白芯片结果。对肝癌组织样本进行实时定量PCR实验分析蛋白芯片筛出的分泌因子与ACTA2在mRNA水平表达的相关性。我们采用NOD/SCID鼠建立皮下瘤体内模型、Transwell小室迁移、侵袭实验、划痕实验以及蛋白印迹实验从体内和体外验证该分泌因子对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。4、Hif1α是缺氧微环境中最常见的促进肿瘤发生侵袭转移的因子。我们分别向肝癌细胞中加入CAF-CM、蛋白芯片筛出的分泌因子以及该分泌因子抑制剂,采用实时定量PCR、蛋白印迹实验以及皮下瘤组织冰冻切片免疫荧光从体内和体外验证该分泌因子对肝癌细胞表达Hif1α的作用。5、我们建立NOD/SCID鼠皮下瘤体内模型,同时采用Transwell小室迁移、侵袭实验、划痕实验和蛋白印迹实验从体内和体外验证该分泌因子通过影响Hif1α的表达对肝癌细胞上皮-间质转化、迁移和侵袭的影响。我们通过在线工具ProteinAltas分析Hif1α表达对肝癌患者生存时间的影响。同时验证常氧条件下CAF对Hif1α泛素化降解的影响。6、我们首先采用蛋白印迹实验验证Hif1α对EMT转录因子ZEB1在蛋白水平表达的影响,然后采用ChIP验证Hif1α对下游靶基因ZEB1转录的影响。我们对肝癌组织样本进行实时定量PCR、冰冻切片双荧光染色,分析Hif1α和ZEB1在肝癌组织表达的相关性。采用Transwell小室迁移、侵袭实验、划痕实验和蛋白印迹实验验证ZEB1对肝癌细胞上皮-间质转化、迁移和侵袭的作用。最后通过通过在线工具ProteinAltas分析ZEB1表达对肝癌患者生存时间的影响。结果:1、HE染色和免疫组织化学染色发现活化的间质细胞在肝癌患者肿瘤组织的分布明显较癌旁组织广。CAF和PTF都具有成纤维细胞特征且均无上皮细胞和内皮细胞的污染。蛋白印迹结果显示CAF较PTF高表达α-SMA、Vimentin。CAF较PTF有更强的体外迁移能力和增殖能力。2、体内实验结果显示CAF能促进肝癌细胞肺转移。生存分析结果提示CAF能增加肝癌细胞恶性程度,小鼠预后较差。CAF-CM培养后的肝癌细胞上皮-间质转化水平升高、CAF促进肝癌细胞迁移和侵袭较PTF更显著。3、我们用蛋白芯片筛选出CAFs与PTFs分泌因子表达差异最大的趋化因子CCL5,肝癌组织中CCL5和ACTA2在mRNA表达呈正向直线关系。体内和体外实验结果显示CCL5能促进肝癌细胞发生EMT、明显增强其迁移和侵袭能力。4、体内和体外实验均证明CCL5能促进肝癌细胞表达Hif1α。5、CAF分泌的CCL5能抑制Hif1α的泛素化降解而增强其稳定性促进肝癌细胞发生EMT致其迁移和侵袭能力增强。在线工具生存分析结果提示Hif1α表达在肝癌组织的异常增高意味着肿瘤进展及预后不良。6、实验结果提示CAF活化的Hif1α入核后能促进下游靶基因ZEB1的转录,肝癌细胞EMT水平升高、迁移和侵袭能力增加。生存分析结果提示ZEB1表达在肝癌组织的异常增高意味着预后不良。结论:从人肝癌组织中分离得到的CAF通过分泌趋化因子CCL5诱导Hif1α/ZEB1的表达促进肝癌细胞发生EMT从而增强其侵袭和转移能力。