禽白血病病毒（avian leukosis virus）是一种可引起禽类的肿瘤性疾病的逆转录病毒。ALV-J首次于1988年分离自英国商业肉用型鸡,迅速蔓延至全球家禽业,造成巨大的经济损失。当前没有有效的疫苗和药物用于控制ALV感染,因此,以淘汰阳性鸡来抑制该病的传播。目前常用鉴别诊断禽白血病毒的方法多为实验室检测,较为耗时,基于此,本研究建立一种简便,耗时短的检测ALV的方法,为ALV的防控提供技术支持。1、本研究首先根据ALV-p27的基因序列设计出一对特异性引物,以ALV c DNA为模版,进行PCR扩增,亚克隆至p GEX-6P-1、p ET-32a载体,重组载体构建成功后转化到E.coli DH5α感受态细胞,PCR筛选出的阳性质粒,转化到E.coli BL21感受态细胞,加入诱导剂IPTG诱导目的蛋白的表达,并用SDS-PAGE分析蛋白表达形式,结果显示GST-p27蛋白大小在52 KDa左右,在28℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导12 h表达量最佳;His-p27蛋白大小在44 KDa左右,在16℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导16 h表达量最佳;两种蛋白均在上清表达。分别用GST标签纯化凝胶、His标签纯化凝胶对融合蛋白进行纯化。BCA法测定蛋白浓度分别为2 mg/m L、1 mg/m L。2、将纯化后的His-p27融合蛋白与弗氏完全佐剂等容量混合作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,间接ELISA测得血清效价为1:819200,Western Blot显示鼠源多克隆抗体与免疫原反应良好;将纯化后的GST-p27融合蛋白与弗氏完全佐剂等容量混合,免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体,间接ELISA测得血清效价1:409600,Western Blot显示兔源多克隆抗体与免疫原反应良好;用蛋白质A+G琼脂凝胶对鼠源多克隆抗体和兔源多克隆抗体进行纯化,得到纯化的鼠源多克隆抗体Ig G和兔源多克隆抗体Ig G。3、将纯化后的鼠源多克隆抗体Ig G与荧光微球偶联后喷涂到玻璃纤维膜上作为样品垫,将纯化后的兔源多克隆抗体Ig G用抗体稀释液稀释至2 mg/m L,作为T线划线溶液;山羊抗兔用抗体稀释液稀释至1 mg/m L作为C线划线溶液;用连续贴膜划膜仪将稀释好的兔源多克隆抗体和的山羊抗兔Ig G划到NC膜上,分别作为T线和C线,烘干后切条组装POCT荧光微球免疫层析检测试纸条。向样品孔滴入禽白血阳性样品液80μL,静等15 min后,在紫外灯下T线和C线均发出荧光。本研究成功制备了可溶性的GST-p27和His-p27融合蛋白以及鼠源多克隆抗体、兔源多克隆抗体,并以此为基础初步建立了point-of-care testing荧光微球免疫层析定性检测ALV的方法,为禽白血病的种群净化特别是禽白血病的检测提供一种更为简便的方法,为基层检查提供便利。