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在植物整个生长周期中总会遭遇不同情况的逆境胁迫,无论是生物胁迫或者是非生物胁迫都会对植物生长发育造成一定的影响。近年来,转录因子逐步成为了分子生物学研究领域的热点,转录因子能够激活一系列下游基因的表达或是参与各种代谢途径的调控来保障植物正常的生长发育。实验室在前期转录组测序研究中发现晚疫病高抗马铃薯加湘1号接种晚疫病菌24小时后,一个R2R3转录因子(StR2R3)相比对照表达量显著上调。为了进一步研究该基因的功能,本实验筛选了适合马铃薯的荧光定量内参基因,分别在生物胁迫(马铃薯晚疫病菌),非生物胁迫(干旱,高盐,高温,低温)的条件下研究了其表达量变化情况,克隆构建了该基因的植物超表达载体和RNAi载体,并利用农杆菌浸泡法将该基因的超表达载体转化拟南芥,主要研究结果如下:1、马铃薯荧光定量内参基因的筛选:利用实时荧光定量PCR技术分别检测了生物胁迫和非生物胁迫处理后加湘1号10个内参基因ELF、EF-1β、CYP、ADF、Actin、GAPDH、E2、His、eEF、α-tubulin的表达稳定性,并利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper三种分析软件比较分析了实验数据,结果表明ELF表达量在不同处理后表达均相对稳定,适宜作为马铃薯基因表达定量检测的的内参基因。2、胁迫诱导表达分析:分别在接种马铃薯晚疫病菌、模拟干旱、高盐、高温、低温的各个单一胁迫环境下对马铃薯转录因子StR2R3基因进行了实时荧光定量检测,通过对其相对表达量的分析发现,在接种马铃薯晚疫病菌后,StR2R3基因在24h内表达量显著上调,接种后48h-72h期间,表达量缓慢下降;20%PEG模拟干旱处理下,StR2R3基因的表达量先下调后显著上调;150mmol/L Nacl高盐溶液处理下,StR2R3基因的表达量先上调后缓慢下降;在35℃高温胁迫和4℃低温胁迫下,StR2R3基因均不表达。3、基因克隆和序列分析:以马铃薯加湘1号为材料,根据基因序列设计引物,从加湘1号的DNA中通过PCR的方法扩增获得了StR2R3转录因子,该基因长958bp,编码一个含239个蛋白。将该基因的氨基酸序列与其它MYB类转录因子氨基酸序列进行同源性比对及生物信息学分析表明,该基因含有两个MYB的结构域,符合MYB转录因子家族中R2R3-MYB转录因子的结构特征。4、载体的构建:通过酶切、连接将StR2R3基因及片段分别克隆到超表达载体pCXSN和RNAi载体pFGC941中。通过测序和酶切验证,证实StR2R3基因及其片段成功插入了载体中,分别命名为pCXSN-StR2R3和pFGC5941-StR2R3。5、植物超表达载体pCXSN-StR2R3农杆菌转化拟南芥:通过冻融法将pCXSNStR2R3转化至根癌农杆菌GV3101中,采用农杆菌花序侵染法进一步将StR2R3基因转化拟南芥,潮霉素平板筛选及PCR检测得到6个拟南芥T3代纯合阳性植株。