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甘蔗是重要的糖料和能源作物,甘蔗花叶病、黄叶病和螟虫是危害着甘蔗生产的主要病虫害。传统的病虫害防治方法难以彻底解决这些问题,并且危害生态环境。甘蔗管理成本高,减少田间管理成本的抗除草剂甘蔗品种有利于机械化生产。由于甘蔗遗传背景非常复杂,且抗病虫、除草剂的种质资源匮乏,因此,很难通过杂交育种等传统方式获得高抗植株。近年来随着转基因技术的发展和RNAi技术的提出,使培育抗病虫害的多性状聚合的甘蔗品种成为可能。根据本实验室分离合成的甘蔗花叶病Pro和CP基因的保守序列,以及甘蔗黄叶病CP基因的保守序列,通过酶切连接,获得甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病保守序列融合片段,通过正向和反向插入干扰中间载体pHANNIBAL形成双价病毒苷扰结构。同时将Cry1AC基因表达框插入到中间载体pHANNIBAL-Z,将干扰表达载体pART27中的Npt Ⅱ基因表达框由Bar基因表达框替换,最后将干扰结构插入重组质粒pHANNIBAL-Cry1Ac中,利用NotⅠ酶切,回收双价病毒干扰结构和Cry1AC基因表达框片段,连接到添加Bar基因表达框的干扰表达载体pART27-Z上,构建了抗病虫和除草剂四价植物表达载体。采用基因枪轰击和农杆菌浸染将构建的四价植物表达载体转入甘蔗品种FN39、ROC22和FN15的胚性愈伤组织中,通过PPT筛选获得抗性再生甘蔗植株,经过PCR、实时荧光定量PCR以及Bt蛋白试纸检测,获得同时整合四种目的基因结构并表达的四价转基因甘蔗植株。本论文的主要研究成果:(1)采用酶切、连接技术,成功改造干扰中间载体pHANNIBAL(在Spe Ⅰ和Sph Ⅰ位点之间引入Sma Ⅰ位点)和干扰表达载体pART27-Z(用Bar置换NPT Ⅱ);(2)成功构建双价RNAi抗甘蔗花叶病和黄叶病与抗虫及除草剂四价植物表达载体,即 pART27-MC1YCP-Cry1AC、pART27-MC2YCP-Cry1AC 和 pART27-MYCP-Cry1AC,并转化获得工程农杆菌株;(3)建立PPT(草丁膦)筛选梯度,确定了甘蔗品种ROC22、FN39和FN15分别在愈伤组织分化时期和再生苗时期的PPT筛选浓度,在甘蔗愈伤组织分化期为0.8 g/L,在再生苗生长期,FN39筛选浓度为0.8 mg/L,ROC22和FN15筛选浓度为0.9 mg/L;(4)通过基因枪法和农杆菌介导法,经PPT筛选获得三种抗病虫除草剂转基因甘蔗植株群体;(5)通过PCR、实时荧光定量RT-PCR以及Bt蛋白试纸检测,获得33株四价转化甘蔗植株,其中通过农杆菌介导转化获得5株,通过基因枪介导转化获得28株。