第一部分结直肠癌细胞中Smad4对肿瘤进展与转移的影响目的：研究Smad4在结肠癌增殖、侵袭、转移中的作用及分子生物学机制。方法：慢病毒Smad4shRNA转染CT26细胞，建立Smad4敲减稳定结肠癌细胞系，并筛选5个稳定单克隆细胞株用于实验。前期研究已建立Smad4稳定表达的SW620细胞株。Western Blot与报告基因检测CT26细胞Smad4敲减效果。细胞计数、MTT、Thymidine incorporation检测细胞增殖。锚定非依赖性肿瘤形成实验检测细胞成瘤。细胞划痕实验、tanswell细胞侵袭与迁移实验检测细胞侵袭转移能力。通过Balb/C小鼠皮下种植瘤模型、脾脏注射结肠癌肝转移模型以及盲肠原位种植模型体内检测细胞成瘤与远处转移。免疫组化检测Ki67阳性的结肠癌细胞增殖情况。Western Blotting检测Smad4敲减的CT26与Smad4过表达的SW620中非Smad通路相关蛋白、细胞周期蛋白、细胞增殖与凋亡相关蛋白。结果： Smad4敲减的CT26单克隆细胞株Smad4的表达明显下调，其下游报告基因p3TP-Lux与(GAGA)9MLP-Luc活性由于Smad4的敲减而对外源性TGF-刺激没有明显应答。Smad4稳定敲减的克隆与CT26亲代细胞和空质粒克隆相比，其细胞增殖、体外成瘤、侵袭、迁移能力明显增强。在盲肠原位种植模型中，Smad4稳定敲减的细胞克隆的原发瘤明显大于对照组。Smad4敲减组15只小鼠中有9只发生肝内转移，其中2只合并脾转移，而对照组10只小鼠仅有1只出现肝门静脉转移，未见明显肝内及脾脏转移。皮下成瘤实验，Smad4敲减组肿瘤生长显著快于对照组；在脾脏注射肝转移模型中，Smad4敲减组肝转移瘤与对照组相比显著增大。在CT26细胞Smad4敲减组与SW620细胞Smad4缺失组Akt与p38-MAPK被激活，而ERK的磷酸化在CT26细胞中与Smad4的水平没有显著关系。在两个细胞系中，Smad4下调c-Myc与CyclinD1，而上调p21Cip1与p27Kip1。在SW620中Smad4下调CDK2，但在CT26中CDK2没有明显变化。另外，在SW620细胞中Smad4下调抗凋亡因子Bcl-w与Bcl-2；在CT26细胞Smad4下调Bcl-w，而Bcl-2表达缺失。相反，在CT26中Smad4上调促凋亡因子Bim和Bad。Western Blot检测CT26小鼠种植瘤组织中以上因子的表达结果与体外实验一致。结论： Smad4缺失促进结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移和肿瘤形成。在结直肠癌中，Smad4通过细胞周期停滞和促进细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖。 Akt在这个过程中可能起到关键作用。第二部分结直肠癌中Smad4对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的作用目的：通过提内外研究探讨Smad4在结直肠癌对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响及其潜在的作用机制。方法：用不同浓度的5-氟尿嘧啶处理Smad4敲减的CT26细胞克隆和Smad4过表达的SW620细胞克隆及相应的空质粒细胞克隆，MTT检测细胞增殖情况。计算5-氟尿嘧啶的IC50用以评价药物敏感性。锚定非依赖性体外成瘤实验检测5-氟尿嘧啶对Smad4敲减或过表达后的结直肠癌细胞体外成瘤的影响。流式细胞分析检测Smad4对5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡的作用。建立小鼠皮下成瘤模型，用5-氟尿嘧啶治疗小鼠，绘制肿瘤生长曲线用以评价肿瘤对5-氟尿嘧啶的敏感性，并研究5-氟尿嘧啶治疗对小鼠总生存期的作用。免疫组化检测Ki67和Cleaved-Caspase3在皮下瘤组织中的表达，评价5-氟尿嘧啶治疗对Smad4不同表达状态的结肠癌增殖与凋亡的作用。Western blotting检测5-氟尿嘧啶处理结直肠癌细胞后Akt通路及下游相关因子的表达，分析寻找Smad4在结直肠癌对5-氟尿嘧啶化疗敏感性中可能的作用机制。结果： CT26亲代细胞或空质粒细胞克隆与SW620稳定过表达Smad4的细胞克隆对5-氟尿嘧啶的敏感性显著高于Smad4敲减或缺失的细胞克隆。Smad4敲减的CT26细胞克隆对5-氟尿嘧啶的IC50高于对照细胞的2倍；SW620对照细胞对5-氟尿嘧啶的IC50高于Smad4过表达细胞克隆的3倍。体外成瘤实验显示5-氟尿嘧啶将CT26对照细胞的集落实抑制85%，而对Smad4敲减的CT26细胞克隆仅抑制18%；5-氟尿嘧啶将SW620对照细胞的集落实抑制46%，而对Smad4过表达的细胞克隆抑制89%。5-氟尿嘧啶治疗在CT26对照细胞中诱导15.3±3.8%的细胞凋亡，而在Smad4敲减的细胞克隆中诱导6.4±1.6%的细胞凋亡。5-氟尿嘧啶治疗在SW620对照细胞中诱导26.3±3.4%的细胞凋亡，而在Smad4过表达细胞克隆中诱导47.3±6.2%的细胞凋亡。体内试验显示Smad4敲减或缺失的皮下瘤对5-氟尿嘧啶耐药，而Smad4高表达的肿瘤对化疗敏感。Smad4缺失或敲减后明显缩短小鼠的生存期。5-氟尿嘧啶治疗可以明显延长Smad4高表达肿瘤小鼠的生存期，而对Smad4缺失的肿瘤小鼠生存期无显著影响。免疫组化提示5-氟尿嘧啶可以诱导Smad4高表达肿瘤的细胞凋亡而抑制增殖，但这一功能在Smad4缺失的肿瘤中明显降低。在5-氟尿嘧啶处理下，Smad4敲减或缺失的结肠癌细胞中Akt处于激活状态，Bcl-2、Bcl-w和survivin表达与p-Akt呈正相关，而Bim的表达与p-Akt呈负相关。结论： Smad4缺失可以诱导结直肠癌对5-氟尿嘧啶耐药。Akt/Bcl-2通路和Akt/Survivin通路可能参与Smad4缺失诱导的结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶耐药。第三部分Smad4缺失通过激活Akt通路及促进血管生成诱导结直肠癌对5-氟尿嘧啶化疗耐药目的：研究Smad4缺失诱导结直肠癌对5-氟尿嘧啶耐药的分子生物学机制。方法：用5-氟尿嘧啶和PI3K抑制剂LY294002处理CT26和SW620细胞后，用MTT检测细胞增殖，并用流式细胞分析检测细胞凋亡情况，评价LY294002在Smad4缺失诱导的5-氟尿嘧啶耐药中的作用。用Western blotting检测Akt/Bcl-2和Akt/Survivin通路，以及Caspse3和PRAP的活化情况。研究CT26细胞皮下瘤在5-氟尿嘧啶治疗前后以及盲肠原位肿瘤的血管生成情况，并用CD31免疫组化分析血管数量和血管密度。Western blotting检测CT26与SW620细胞在Smad4敲减或过表达后的VEGF表达情况，同时检测CT26皮下瘤、盲肠原位瘤以及肝转移瘤中VEGF表达水平。最后，我们通过Western blotting和组织芯片免疫组化分析，探讨结直肠癌中Smad4的变化，以及Smad4与Akt、Bcl-2或Bcl-w的关系。我们同时分析了Smad4阴性组和阳性组的总生存期。结果：在LY294002同时处理时，Smad4缺失或者敲减的克隆对5-氟尿嘧啶敏感性显著增强。而CT26的对照组和SW620的Smad4过表达克隆在LY294002处理后，对5-氟尿嘧啶的敏感性变化不大。LY294002单药治疗对CT26和SW620细胞凋亡无明显影响。LY294002显著增加了Smad缺失或敲减细胞中5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡，这一作用在Smad4高表达的细胞中并不显著。Smad4缺失激活了Akt的磷酸化，而LY294002处理后将Akt的激活降低到Smad4高表达的细胞相似的水平。Bcl-w和Bcl-2的表达与Akt的激活呈正相关。LY294002还可以扭转Smad4敲减的细胞中的Bim的表达。5-氟尿嘧啶治疗后，Smad4敲减的细胞中Survivin表达升高，而LY294002处理后可以降低Survivin的表达。5-氟尿嘧啶治疗后，Smad4敲减或缺失的细胞的Caspase3和PARP没有明显激活，但LY294002与5-氟尿嘧啶发挥协同作用，促进Caspase3和PARP的活化。Smad4敲减后，CT26细胞和肿瘤组织中的VEGF表达上调。相反，Smad4过表达后，SW620细胞中VEGF表达下调。CD31免疫组化染色显示，CT26皮下瘤和原位瘤中Smad4敲减后血管数量和密度都显著增加。Western blotting检测8例结直肠癌中，5例肿瘤中的Smad4表达显著低于对应正常结肠组织，另有2例Smad4水平也稍有减低。在5例Smad4明显减低的肿瘤中，Akt磷酸化显著增强。组织芯片分析提示，Smad4阴性的肿瘤组织Bcl-2和Bcl-w水平升高；肿瘤中Smad4阴性的结直肠癌患者的总生存期明显低于Smad4阳性组。结论：Smad4缺失通过激活Akt通路诱导结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗耐药。Smad4缺失通过上调VEGF而诱导肿瘤血管，是结直肠癌对5-氟尿嘧啶耐药的另一可能因素。