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近交小型猪是理想的异种器官移植的供体，具有清楚的遗传背景，高度的纯合性和近交耐受性。猪-灵长类异种器官移植存在由1，3半乳糖（Galactose-1，3-galactose，Gal-1，3Gal，或Gal）异种抗原引起的超急性排斥反应（Hyperacuterejection，HAR），是异种器官移植的主要障碍。敲除合成Gal-1，3Gal的1，3半乳糖基转移酶基因（-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）是解决HAR的第一步。尽管先前的研究已利用传统同源重组（Homologous recombination，HR）和体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）的方法获得GGTA1基因敲除猪（Gene knockout，KO），但效率低，且由于繁殖力低和所用猪种不能克服近交衰退等原因，不能通过育种方式实现基因修饰动物大规模的扩繁。转录激活因子样效应核酸酶技术（Transcription Activator-like (TAL) Effector Nucleases，TALENs）是近年来发展起来的靶向基因敲除技术，与锌指核酸酶技术（Zinc-finger nuclease，ZFNs）作用原理类似，TALENs能在特定靶序列上介导DNA双链断裂，引起移码突变，高效率地在特定的靶位点沉默基因表达。TALENs技术在特异性、灵活性和低毒性等多方面都优于ZFNs技术，且实验操作简单，更易获得。TALENs已成功地应用于多种动物类型，但目前利用TALENs技术获得基因打靶猪的研究报道不多。尽管高效的基因修饰技术极大地提高了细胞水平上进行基因修饰的效率，但猪的体细胞克隆效率低，克隆动物易出现出生体重异常，器官缺陷，先天疾病等问题，不易通过克隆技术获得大规模数量的克隆猪，又由于之前所用猪种不能克服近交衰退，无法通过育种方式进行有效的扩群。因近交动物具有清楚的遗传背景、高度的纯合性和近交耐受性，而利用近交动物的细胞为供体细胞，经SCNT获得稳定的基因修饰动物后，可通过连续的近交扩大种群数量，避免采用普通实验动物所面临的近交衰退现象，为建立起稳定可靠的基因修饰猪品系研究奠定基础。在本研究中，从版纳微型猪近交系（Banna Mini-pig Inbred Line，BMI）的JS151家系获得7个妊娠35d胎儿，分离猪胎儿成纤维细胞（Porcine fetal fibroblastsPFFs），利用SRY-PCR法鉴定猪胎儿性别。针对GGTA1基因的外显子6，设计构建了2对TALENs，即TALENs Set1#和TALENs Set2#，为了检测TALENs的打靶效率，经体外转录的获得TALENs mRNA，显微注射到1细胞期的猪孤雌激活胚胎。在检测的孤雌激活囊胚中，TALENs Set1#在GGTA1靶位点插入/缺失突变的效率高达73.1%（19/26）。将TALENs质粒对与带有新霉素基因neo的质粒pcDNA3.1共转染BMI雌性胎儿成纤维细胞。经8-10d的筛选，在获得细胞克隆中，TALENs Set1#打靶效率达到89.5%（187/209）。值得注意的是，有27.8%（58/209）的细胞克隆是双等位基因敲除。5株基因双敲的细胞株作为核移植的供体进行SCNT，获得了3头GGTA1基因双敲除的雌性小型猪。经检测3头猪的细胞表面Gal表位完全缺失。GGTA1基因敲除猪的成纤维细胞比野生型猪的细胞在含补体的正常人血清中具有更高的溶解耐受性。在已获得GGTA1KO的版纳微型猪近交系母猪的研究基础上，为了能通过育种方式扩大纯合GGTA1基因敲除猪的数量，下一步研究是构建GGTA1KO公猪。选择BMI的雌性胎儿成纤维细胞为供体，进行TALENs转染和筛选，细胞水平上GGTA1基因敲除效率为72.5%，构建重构胚后经SCNT移植到6头受体母猪，检测到2头怀孕，其中一头受体在妊娠79d流产1头GGTA1基因敲除公猪，另1头受体母猪生产了1头GGTA1基因敲除公猪。利用获得的GGTA1KO公猪和母猪，为下一步通过连续的近交方式扩大种群研究奠定了基础。本研究利用TALENs技术结合体细胞核移植技术能高效直接地获得GGTA1基因敲除猪。在本研究中获得的带有近交特征的小型猪为异种器官移植研究奠定了技术基础。