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肽聚糖识别蛋白作为一类可识别肽聚糖和含肽聚糖病原菌的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR),在先天免疫防御系统中发挥重要的识别作用和调节功能。本实验克隆了三角帆蚌HcPGRP short、HcPGRP long、HcPGRP S2基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR方法检测三角帆蚌三个基因在三角帆蚌血细胞、肝胰腺、鳃、闭壳肌、外套膜等五种不同组织中的表达,通过PBS、肽聚糖、嗜水气单胞菌的刺激诱导蚌后,检测三个基因在蚌的血细胞、肝胰腺、鳃组织中表达变化。用基因重组技术构建pET30-HcPGRP long及pET30-HcPGRP S2原核表达载体,利用大肠杆菌表达系统进行表达并纯化出蛋白。HcPGRP short基因的全长为1493 bp,开放阅读框为858 bp,编码了 285个氨基酸组成的蛋白质,其中包含5’ UTR(非编码区)的长度为127 bp,3’ UTR长度为508bp;HcPGRP long基因的全长为1200 bp,开放阅读框为462 bp,编码了 154个氨基酸组成的蛋白质,其中包含5’ UTR的长度为334bp,3’ UTR长度为404bp;HcPGRP S2基因的全长为1037bp,开放阅读框为657 bp,编码了 219个氨基酸组成的蛋白质,其中包含5’ UTR的长度为287bp,3’ UTR长度为93bp。这三个基因都含有II型N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶结构域,也称为PGRP结构域。HcPGRP short和HcPGRP S2在蛋白N端都含有信号肽(HcPGRP short:MAALHITTSMSRASVLTAYRLFICFVCARCLLRNVNG;HcPGRP S2:MFQSSFRRLELNCHEPEEITMWLLFLVTLCVLSCEG)和潜在的N-糖基化位点(HcPGRP short:40(NPTH)和 92(NYSC);HcPGRP S2:44(NVTL));HcPGRP short 和 HcPGRP long 都含有跨膜结构域,预测 HcPGRP short为分泌型的跨膜蛋白,HcPGRP long为跨膜蛋白,HcPGRP S2为分泌型蛋白。系统进化树显示三角帆蚌这三个基因与夏威夷短尾鱿鱼EsPGRP4聚为一枝,表明他们之间进化关系密切。多重序列比对显示,HcPGRP short和HcPGRP long中能与Zn2+结合及维持酰胺酶活性位点只有部分保守,HcPGRP S2则高度保守;HcPGRP short和HcPGRP long中能与DAP型PGN特异性结合的三个氨基酸位点高度保守,而HcPGRP S2部分保守。使用荧光定量PCR检测到三个基因在三角帆蚌不同组织中均有表达,且表达量大小有相同的趋势,表达量由高到低依次为肝胰腺、鳃、外套膜、闭壳肌、血细胞。其中HcPGRP short在肝胰腺的表达量为血细胞的6.61倍;HcPGRP long在肝胰腺的表达量为血细胞的11.29倍;HcPGRP S2在肝胰腺的表达量为血细胞的4.95倍,而HcPGRP long在各组织的表达量均是这三个基因中最低的。经肽聚糖和嗜水气单胞菌刺激后,除了 HcPGRP long基因在血细胞中无显著的表达差异,这三个基因各自在血细胞、肝胰腺和鳃各组织中都有表现出显著或极显著的表达差异。这三个基因通过嗜水气单胞菌刺激后分别在这三个组织中的某时刻表达量都表现出显著或极显著高于PBS刺激,而通过肽聚糖刺激后只在部分组织出现表达量显著高于PBS刺激。通过质粒 pET-30 建立重组质粒 pET30-HcPGRP long 和 pET30-HcPGRP S2在诱导破碎后发现以包涵体的形式存在,HcPGRP S2的包涵体经变性复性后纯化得到了有活性的可溶性重组蛋白,HcPGRP long经变性后纯化得到可溶性重组蛋白。