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胡椒碱是黑胡椒中主要的刺激性成分,胡椒的食用价值及药用价值都源于胡椒碱的这种辛辣感。研究发现胡椒碱具有广泛药理作用,如可以抗癫痫,抗炎、抗氧化,保护胃肠道,提高药物的生物利用度以及减肥等。前期研究发现胡椒碱与辣椒素作用于同一受体,即辣椒素受体—TRPV1（Transient Receptor Potential Vanilloid1）。TRPV1是TRP超家族中的重要成员之一,是一种非选择性的离子通道,可以被酸、热、动物毒素和多种内源性物质所激活,当其被激活时可引起钙、镁等多种阳离子的内流,从而触发神经元的动作电位;又因其在机体中的广泛分布,能够参与调节多种生物学过程,如TRPV1参与疼痛的产生与传导以及参与一些炎症及免疫应激过程。辣椒素是辣椒产生辛辣感的主要活性成分,辣椒素的香草基头部和酰胺颈构成其亲水部分,而脂肪酸链尾是其疏水部分。近期的相关研究已开始揭示辣椒素激活TRPV1的结构机制,即辣椒素以“头朝下,尾朝上”的方式与TRPV1结合,其中TRPV1中的T551与E571位点分别与辣椒素的颈部酰胺基与头部羟基形成两个氢键而稳定结合构象。前期研究已证明胡椒碱也可以激活TRPV1,然而胡椒碱与辣椒素在结构上存在着巨大差异,辣椒素与TRPV1相互作用的几个关键基团胡椒碱都不具备,这提示胡椒碱可能与TRPV1的其他位点相互作用而激活通道开放。目的:探究胡椒碱对TRPV1的激活能力,以及通道中关键位点突变后,胡椒碱对TRPV1的激活能力是否发生改变,从而探讨胡椒碱激活TRPV1的结构机制,并利用计算结构建模来探索piperine-TRPV1的潜在相互作用。方法:本研究利用活细胞钙成像和膜片钳电生理记录相结合的方法,研究胡椒碱激活TRPV1的关键突变位点的功能变化,并利用分子对接计算结构建模来探索piperine-TRPV1的潜在相互作用。结果:活细胞钙成像结果显示:在一定范围内随着胡椒碱浓度的升高荧光强度也不断增强,且激活量效曲线显示EC50为3.3±0.7μM（n=5）,且当胡椒碱浓度增至30μM时细胞荧光强度呈下降趋势。因此,钙成像结果表明,胡椒碱能激活TRPV1,但其作用低于辣椒素。钙成像记录显示10μM胡椒碱对表达野生型mTRPV1的HEK293细胞的荧光激活强度几乎完全被10μM CZP（capsazepine）所抑制。由于CZP是辣椒素的竞争性拮抗剂,因此上述结果表明胡椒碱和辣椒素虽然具有不同的结构,但它们有可能结合到相同的配体口袋里。通过对辣椒素和TRPV1潜在相互作用位点进行突变,得到T551V和E571A两种TRPV1的突变质粒。钙成像实验表明,胡椒碱激活E571A的EC50值（3.5±0.5μM,n=5,P>0.05）和效能（77.1±7.3%,n=5,P>0.05）,与野生型TRPV1（3.3±7μM,P>0.05,82.7±5.7%,n=5,P>0.05）相比没有显著差别。同样,激活T551V的EC50值（5.1±27μM,n=5,P>0.05）也没有明显变化。另外,与野生型TRPV1相似,T551V和E571A的荧光信号在30μM胡椒碱时呈下降趋势。综上所述,胡椒碱在激活TRPV1时似乎与T551和E571两个位点都没有实质性的相互作用,至少未与这些位点形成氢键。膜片钳单通道记录结果显示通道开放几率（Po）随着胡椒碱浓度的增加而增加,但是即使在30μM胡椒碱存在的情况下Po值仅为10%,预测最大Po大约36%,这比钙成像观察到的要低得多;并且单通道记录的EC50值252.3±38.1μM显著高于钙成像结果。此外,30μM胡椒碱时的开放几率并不低于10μM胡椒碱。已知钙离子介导通道脱敏,而膜片钳溶液的浴液中无钙离子存在,故这些现象都可以解释为钙信号不仅反映了TRPV1的通道活动,还反映了其他时间和空间内的钙转运整合过程。膜片钳单通道记录显示胡椒碱激活E571A突变体的EC50值为276.8±36.5μM（n=4,P>0.05）,而最大激活开放概率预测值仅为22%。T551V突变体的EC50值（93.5±15.1μM,n=4）显著低于野生型的EC50值（P<0.01）,但是T551V的最大开放概率约为93.5±15.1μM（n=4）,明显高于野生型（P<0.05）。上述结果表明,胡椒碱并不直接与E571位点相互作用,但它确实与T551位点相互作用,尽管不是通过氢键。分子对接数据未表明T551或E571可以与胡椒碱形成稳定的氢键,但是位于S6片段中间的T671位点被认为具有最高的平均氢键能,也贡献了大量的VDW能量。我们发现胡椒碱能够激活T671S突变体,且呈浓度依赖性,但激活能力大大降低。而对于T671V突变体即使使用30μM的胡椒碱,也未观察到通道的开放。结论:本研究中我们也发现胡椒碱与辣椒素结合在TRPV1的相同位点,但不同的是与辣椒素相比,胡椒碱的通道激活能力较弱。并且当把与辣椒素相互结合时参与形成氢键的两个位点—T551和E571突变为疏水氨基酸时,并未发现胡椒碱激活能力的下降,故胡椒碱不像辣椒素直接与E571或者T551位点相互作用形成氢键。分子对接的计算结构模型显示,胡椒碱与配体结合袋中的多个氨基酸结合位点发生疏水作用,其中T671位点贡献较大的分子间作用力,且当改变该位点发生后降低了胡椒碱的激活能力,即T671位点在胡椒碱激活TRPV1过程中可能发挥重要作用。