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目的：幽门螺杆菌(H. pylori)是定植于人类胃粘膜上皮细胞表面的一种细菌,与胃十二指肠疾病的发生和发展密切相关。分析胃十二指肠疾病高发区(威海)H. pylori临床分离株毒力因子的分子特征(包括cagPAI、vacA基因和dupA基因),以评价该地区H. pylori I临床分离株的毒力。研究该地区H. pylori菌株的dupA基因功能,以探讨H. pylori dupA基因的致病机制。方法：1.选取胃十二指肠疾病高发区(威海)临床就诊的患者,进行胃粘膜组织分离培养H. pylori菌株。采用PCR扩增结合测序的方法,分析H.pylori I临床分离株cagPAI (cagA, cagE, cagl, cagL, cagM, cagT和cagX基因)、cagA基因3’端可变区、vacA基因和dupA基因类型,与NCBI (National Center of Biotechnology Information)中相关序列进行比对。并根据基因序列获得了相应蛋白的氨基酸序列,采用MEGA4.1构建相应系统发育树。2.研究分离于十二指肠溃疡患者的H. pylori WH-21菌株携带的dupA基因类型,并对其蛋白进行生物学信息学分析,包括该蛋白一级结构、二级结构和三级结构特征及该蛋白细胞定位和功能结构域等。3.构建pET-32a-dupA原核表达载体,转化于E. coli Rosetta(DE3)中。经IPTG诱导后表达重组DupA蛋白,以Ni2+-NTA珠分离纯化目的蛋白。利用ATPase分解ATP生成无机磷的原理,检测重组DupA蛋白的ATPase活性。采用动物实验制备抗重组DupA蛋白多克隆抗血清。4.利用Western blotting法检测DupA (2499)蛋白的亚细胞定位。采用免疫共沉淀实验和质谱分析方法,进行DupA (2499)蛋白的互作蛋白分析。5.构建敲除载体pBluescript/△dupA::KMr,采用同源重组的方法构建H. pylori dupA (2499)基因缺失株。6. H. pylori和GES-1细胞共培养后,采用Western blotting方法分析dupA (2499)基因的缺失对H. pylori CagA蛋白转运的影响,以及CFU实验和粘附率实验分析H. pylori dupA (2499)基因缺失株的粘附功能。7.分析不同pH值液体培养基中H. pylori生长情况,研究IH. pylori dupA (2499)基因缺失株对酸性环境的抵抗力。采用Western blotting,分析培养后上清液中脲酶含量。H. pylori和GES-1细胞共培养,采用ELISA方法分析上清液中IL-8的浓度,分析H. pylori dupA (2499)基因缺失株毒力变化。8. H. pylori和MKN-45细胞共培养后,采用MTT方法检测H. pylori dupA (2499)基因缺失株的细胞毒变化,Hoechst33258染色后显微镜下观察H. pylori dupA (2499)基因缺失株对肿瘤细胞形态变化的影响,Western blotting分析线粒体通路的凋亡相关分子标志变化,包括活化Caspase-3, PARP, Bax和Bcl-2变化。结果：1.经过PCR扩增后,116株H. pyloril临床分离株均携带cagA, cagL, cagM, cagT和cagX基因,而只有89.7%(104/116)和82.8%(96/116)菌株分别扩增出cagE和cagI基因。25.9%(30/116)菌株中发现cag部分缺失,其中cagPAI部分缺失株在慢性胃炎中占44.4%(24/54)显著高于胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌(9.7%,6/62)咖<0.001)。未发现cagPAI完全缺失的H. pylori菌株。24株菌株cagA3’端可变区氨基酸序列可分为两大群：东亚型(91.7%)和西方型(8.3%),其中前者为EPIYA-A-B-D型,后者为EPIYA-A-B-C型。CagPAI蛋白中除了CagL蛋白外,CagI、CagM、CagT和CagX蛋白序列均为保守。系统发育树提示CagPAI蛋白也分为两个群：东亚型和西方型,大部分菌株也属于东亚型。H. pyloril临床分离株vacA基因s区和m区的主要流行模式为s1a/m2(48.3%)和slc/m2(13.8%)。31.0%的H. pylori临床分离株携带dupA基因,其中在胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌携带率为40.3%,高于慢性胃炎(20.4%,p=0.02)。dupA基因序列分析显示其读码框架为2499bp,称作dupA (2499)基因。2. H. pylori WH-21菌株携带的dupA基因全长2499bp,称作dupA (2499)基因。威海地区8株dupA碱基序列同源性为99.3%,与日本两株H. pylori菌株的dupA基因碱基序列同源性为99.25%,不同地区14株H. pylori dupA碱基序列同源性为91.65%。生物信息学分析发现DupA (2499)蛋白为稳定亲水性蛋白质,抗原性强。无信号肽且有多个跨膜区,定位于细胞内膜。a螺旋是该蛋白多肽链中主要组成结构元件,具有一个卷曲螺旋结构。三维结构预测其配体结合物质为ADP、ATP和Mg2+等。与CagE_TrbE_VirB超家族有较高的同源性,具有ATP结合位点。3.获得了重组DupA蛋白,该蛋白ATPase活力为129.5±17.8/mgprot。成功制备了抗重组DupA蛋白多克隆抗血清,抗体效价为1：6.4x104。4. Western blotting结果显示DupA (2499)蛋白定位于胞膜。经过免疫共沉淀实验和质谱分析,DupA (2499)蛋白的互作蛋白为脲酶和HSP60。5.获得了H. pylori dupA (2499)基因缺失株,并通过了PCR和Western blotting的验证。6.采用H. pylori感染GES-1细胞后,缺失株组和野生株组向胞内转运CagA蛋白无差别。CFU实验结果[(27.2±7.1)×106和(28.5±6.9)×106,p=0.772]和粘附率实验结果(81.0%和78.8%,p=0.724)均无明显差异。7.除pH6.5-pH7.5之外,其它酸性环境下野生株组菌量显著高于缺失株组(p<0.05)。缺失株组的脲酶分泌低于野生株组,特别在酸性环境时。细菌细胞共培养后,野生株组上清液中IL-8浓度显著高于缺失株组(p<0.001)8.与对照组比较,细菌细胞共培养12h后MKN-45细胞存活率开始降低,缺失株组MKN-45细胞存活率显著高于野生株组(p<0.05)。细菌细胞共培养12h后,Hoechst33258染色结果显示缺失株组和野生株组均可以引起MKN-45细胞凋亡,但野生株组凋亡率显著高于缺失株组(p<0.05)。6h后野生株组和缺失株组均开始出现Caspase-3和PARP的剪切活化,野生株组强于缺失株组。与缺失株组比较,野生株组Bax明显上调而Bcl-2则明显下调。结论：1.胃十二指肠疾病高发区(威海)H. pylori I临床分离株为强毒株,与该地区的胃十二指肠疾病高发相关。H. pylori强毒性特征与东亚型cagA基因3’端可变区、完整的cagPAI、东亚型cagFAI基因、强毒性vacA基因和dupA (2499)基因有关。2.dupA (2499)基因保守且同源性高,适宜进行体外表达。DupA (2499)蛋白稳定且抗原性强,适合抗体的制备。3. DupA (2499)蛋白独立于CagPAI之外,存在于H. pylori的内膜,具有ATPase活性并参与脲酶的分泌,但不参与H. pylori的CagA蛋白的转运和其粘附过程。4. H. pylori DupA(2499)蛋白参与脲酶分泌的调节,使携带dupA (2499)基因的H. pylori菌株具有更强的耐酸特性。耐酸特性和刺激IL-8分泌的特性,与携带dupA基因H. pylori菌株引起十二指肠溃疡高发密切相关。DupA (2499)蛋白通过线粒体通路诱导肿瘤细胞凋亡,与携带dupA基因的H. pylori菌株降低胃癌发病相关。