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脂多糖(LPS),是革兰氏阴性细菌外壁的主要成分,可致内毒素性急性呼吸窘迫综合征,目前尚无理想的抗内毒素治疗药物。正常情况时人体内LPS的水平很低,即使在革兰阴性菌脓毒血症时,血浆中LPS浓度仅为0.01~1ng/ml[1]。LPS发挥致炎作需要LBP/CD14的增敏效应。脂多糖结合蛋白是脂多糖的结合蛋白,能将LPS单体转运至脂蛋白后通过肝脏从体内清除,并可以将LPS递呈给位于单核巨噬细胞及中性粒细胞表面的受体CD14,形成LPS/LBP/CD14三联复合物,启动LPS炎症信号通路,诱发级联炎症效应,导致内毒素性急性呼吸窘迫综合征。LPS/LBP复合物与CD14结合是启动LPS炎症信号通路的关键点,寻找LPS/LBP复合物与CD14的结合位点模拟肽,可以早期阻断LPS炎症信号通路。因此,本研究拟构建LPS/LBP复合物,并以LPS/LBP复合物为底物进行噬菌体十二肽库筛选,获得与LPS/LBP复合物具有较高亲和力,并与CD14竞争结合LPS/LBP复合物的噬菌体克隆。拟通过后续DNA测序后获得LPS/LBP复合物与CD14的结合位点的模拟肽,为进一步研究内毒性急性呼吸窘迫征的防治策略奠定理论基础。目的构建LPS/LBP复合物,筛选LPS/LBP复合物与CD14结合位点的噬菌体克隆。方法1.将LPS与LBP按15:1、10:1、5:1的比例混匀。将LPS/LBP混合物、LBP(浓度分别为200ug/ml和100ug/ml、50ug/ml)、LPS(浓度分别为100ug/ml、50ug/ml)过夜孵育。将LPS/LBP混合物、LBP、LPS行凝胶电泳,经考马斯亮蓝染色后将各条带切取,行蛋白回收,并测定内毒素。2.采用噬菌体肽库筛选技术,以LPS/LBP复合物包被酶标板,行亲和筛选,经过4轮洗脱,使噬菌体得到有效富集。随后分次挑取47个和95个噬菌体克隆,行结合活性实验,将亲和活性大于2倍以上的噬菌体克隆行竞争抑制实验,最终得到与LPS/LBP复合物有亲和力且能与CD14竞争性结合LPS/LBP复合物的噬菌体克隆。结果1.凝胶电泳后,LPS/LBP复合物、LBP泳道于52 KDa处可见考马斯亮兰染色的条带。样本中LBP浓度越高、条带染色越浓,LPS泳道对应于52 KDa处无染色条带出现。各浓度比例的LPS/LBP复合物电泳后凝胶条带回收物中均能检测出内毒素。10:1LPS/LBP复合物组、15:1 LPS/LBP复合物组复合物内毒素浓度显著高于5:1 LPS/LBP复合物组内毒素浓度(P<0.05)。10:1 LPS/LBP复合物组与15:1 LPS/LBP复合物组内毒素浓度无统计学差异(P>0.1)。各浓度LBP组均未检出内毒素,LPS组内毒素检测也为阴性。2.以LPS/LBP复合物为底物行亲和筛选,经过4轮洗脱,富集率由2.35x10-6增加到4.25x10-5,噬菌体克隆得到有效富集。第一次结合活性实验随机挑选47个克隆进行ELISA鉴定其与LPS/LBP复合物的的结合力,结果显12个噬菌体克隆所展示的多肽与LPS/LBP复合物有较高的结合力,OD450高于对照组2倍以上。第二次结合活性实验随机挑取95个噬菌体克隆行结合活性实验,34个噬菌体克隆与LPS/LBP复合物有较高亲和力,OD450高于对照组2倍以上。将这46个噬菌体克隆行竞争抑制实验,有34个噬菌体能与CD14竞争性结合LPS/LBP复合物,竞争抑制力较高的是2-27、2-34、2-50这三个噬菌体克隆。结论1.通过温孵及凝胶电泳可获得纯度较高的LPS/LBP复合物。LPS:LBP为10:1是较为合理的构建LPS/LBP复合物的比例。2.采用噬菌体十二肽库筛选技术,初步获得了LPS/LBP复合物与CD14结合位点的噬菌体克隆,竞争抑制力较高的是2-27、2-34、2-50这三个噬菌体克隆。