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急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童恶性血液病中最常见的疾病,由于化疗方案的不断完善,其治愈率目前已高达80%左右,但仍有部分患儿对化疗不敏感或复发,预后不佳。临床研究表明,复发不仅仅出现于高危组,还会出现在低危或中危组的患儿中,这种现象无疑对当前的危险度分级标准提出了严峻的挑战。因此,不断发掘新的预后因素、完善分级标准、给予患儿针对性的化疗对提高ALL患儿的预后有重要意义。Ik6 (Ikaros isoform 6, Ik6)是Ikaros基因的一个显性负相亚型,由Ikaros基因IKZF1 (Ikaros family zinc finger 1)的外显子3-6缺失形成,是IKZF1缺失的主要形式之一。Ik6能够抑制Ikaros发挥正常的抑制血液系统肿瘤的功能,并且是Ikaros家族中最强的抑制因子。国外研究指出,Ik6在BCR/ABL阳性的ALL中高频出现,且与ALL预后不佳的临床因素密切相关,如原始细胞比例过高、异常细胞遗传学改变、化疗不敏感、难以达到完全缓解等。Ik6还参与细胞的凋亡途径,保护细胞免受外界刺激导致的凋亡。据此,我们推测Ik6可能在急性淋巴细胞白血病的进展中起到一定的作用。慢病毒载体转染法是将外源基因转入悬浮细胞的首选方法,其转导效率高、基因表达稳定持久且细胞毒性较低,其介导的基因过表达或沉默是研究基因功能的经典方法。本研究检测了Ik6在儿童ALL患儿骨髓细胞中的表达,并分析其与临床特征的关系；通过慢病毒介导的基因过表达,探索性研究了Ik6基因对ALL细胞株Nalm-6生长、侵袭及化疗敏感性的影响,旨在进一步认识Ik6基因在ALL中的作用与意义。第一部分Ik6基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义目的：探讨IKZF1及其显性负相基因Ik6在儿童急性淋巴细胞白血病患者中的表达及其临床意义,以初步了解Ik6在ALL发生发展中的作用。方法：应用巢式RT-PCR方法检测88例初诊ALL患儿骨髓单个核细胞中IKZF1基因的表达情况；凝胶回收DNA产物片段并对目的基因测序鉴定；应用多重RT-PCR方法检测ALL融合基因的表达；分析Ik6基因的表达与患者临床特征的关系。结果：最常见的IKZF1亚型是Ik2/3(73.86%),其次是Ikl(42.05%)和Ik4(32.95%)。急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中Ik6基因的阳性表达率分别是11.43%(8/70)和5.56%(1/18)。在8例Ik6阳性表达的B-ALL患者中,3例BCR/ABL阳性,1例HOX11阳性,4例融合基因表达阴性,其中Ik6的表达与BCR/ABL目关(P<0.01)。分析Ik6与患者临床特征的关系发现,Ik6与年龄、白细胞计数、危险度分级及其他遗传学特征无显著相关性(P>0.05),但与诱导化疗后的微小残留病(minimal residual disease, MRD)高水平相关(P<0.01)。结论：Ik6在部分ALL患者中阳性表达,可作为临床预后评估的一项独立指标,可能作为初诊时判断为高危白血病患儿的临床指标之一。第二部分Ik6过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定目的：构建含有人Ik6基因的慢病毒表达载体pHR-CSIGW-Ik6,病毒包装后获得由绿色荧光蛋白标记的病毒颗粒,转染Nalm-6细胞使之表达Ik6蛋白,为研究Ik6在白血病中的作用打下基础。方法：通过RT-PCR方法从人急性淋巴细胞白血病细胞株Sup-B15获得Ik6基因,将其插入pEASY-T质粒上构建重组表达载体pEASY-Ik6,经XhoⅠ、BamHⅠ双酶切后,Ik6片段与慢病毒表达载体pHR-SIN CSIGW连接重组为pHR-CSIGW-Ik6。慢病毒系统在293T细胞中进行病毒包装和滴度测定。慢病毒感染人急性淋巴细胞白血病细胞株Nalm-6后,采用流式细胞术、实时荧光定量PCR及免疫印迹法检测Ik6在Nalm-6细胞中的表达效果。结果：成功构建了pEASY-Ik6和pHR-CSIGW-Ik6载体,经PCR和测序鉴定结果与Ik6基因序列完全一致。在293T细胞中进行病毒包装获得的病毒滴度为2×109TU/ml,满足实验要求。当感染倍数(multiple of infection,MOI)为50时,Nalm-6细胞的感染率可达到80%以上。感染后的Nalm-6细胞,Ik6在转录和蛋白水平表达明显上调(P<0.01)。结论：Ik6过表达载体构建成功,感染效率高、基因表达稳定,为进一步研究Ik6在白血病中的作用奠定了基础。第三部分Ik6过表达对急性淋巴细胞白血病细胞Nalm-6生物学特性的影响目的：研究Ik6过表达对急性淋巴细胞白血病细胞Nalm-6增殖、凋亡及化疗敏感性的影响。方法：采用CCK-8法和集落形成法检测对照组Nalm-6细胞、空载体转染组Nalm-6-mock细胞和Ik6载体转染组Nalm-6-Ik6细胞的增殖和集落形成；CCK-8法检测细胞对化疗药物长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)、门冬酰胺酶(L-Asp)和地塞米松(Dex)的敏感性；采用Annexin-V/FITC PI双染法及流式细胞术检测细胞的凋亡；实时定量PCR和Western Blot法检测化疗药物作用于Nalm-6-Ik6后Ik6的表达。结果：1.慢病毒介导Ik6基因过表达可显著提高Nalm-6细胞的增殖(P<0.05)及细胞克隆的形成(P<0.01)；2.相比较于Nalm-6-mock细胞,Nalm-6-Ik6细胞对诱导缓解治疗药物VCR、DNR和L-Asp的抵抗增加,24小时的工C5。值分别为34.94 ng/ml (vs.20.51 ng/ml)、12.25 ng/ml (vs.1.89 ng/ml)和2.37 IU/ml (vs.0.36 IU/ml) (P<0.05); 3. Nalm-6-mock细胞经VCR、DNR和L-Asp诱导后凋亡显著增加(P<0.05),而Nalm-6-Ik6无明显改变(P>0.05)；4.化疗药物VCR、DNR和L-Asp能降低细胞Nalm-6-Ik6中Ik6 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。结论：Ik6可促进ALL细胞的生长及对化疗药物的抵抗,化疗抵抗的机制复杂,可能与Ik6的抗凋亡作用及本身表达受化疗药物调节相关。第四部分Ik6基因过表达对急性淋巴细胞白血病侵袭的影响目的：探讨Ik6过表达对急性淋巴细胞白血病血管新生及迁移侵袭的影响。方法：实时定量PCR法检测20例B系ALL及10例正常对照患者骨髓单个核细胞中血管新生相关因子VEGF, Flt-1、PlGF, Ang-1和Ang-2的表达,并分析Ik6与血管新生相关因子表达的关系。实时定量法检测Nalm-6-mock和Nalm-6-Ik6细胞血管新生相关因子的表达；Transwell法检测转染前后Nalm-6细胞的迁移和侵袭力。结果：血管新生相关因子VEGF、Flt-1、PlGF、Ang-1和Ang-2的mRNA表达：1.ALL组(n=20)的表达明显高于正常对照组(n=10)(P<0.01)；2.Ik6+ALL组(n=8)和Ik6-ALL组(n=12)的表达无差异(P<0.05)；3.Ik6单独表达的ALL组(n=5)和其他组(n=15)相比较,表达上调但差异无统计学意义(P>0.05)；4. Nalm-6-Ik6细胞和Nalm-6-mock细胞的表达无差异(P>0.05),Spearman相关分析显示Ik6与血管新生相关因子表达无相关性(P>0.05)。Transwell实验也显示转染前后Nalm-6细胞的迁移和侵袭力无明显变化(P>0.05)。结论：Ik6可能不参与急性淋巴细胞白血病的血管新生及转移和侵袭。