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目的:通过辛伐他汀(SIM)对多柔比星(DOX)损伤乳鼠心肌细胞的干预,观察SIM对心肌细胞的保护作用,并探讨其可能的作用机制。
方法:(1)实验模型:用酶消化及差速贴壁法分离、纯化、培养SD乳鼠原代心肌细胞,72小时后用终浓度为1μmol/L的DOX作用24小时建立心肌细胞损伤模型。(2)实验分组:培养72小时的心肌细胞随机分为五组:正常对照组(C组)、DOX损伤组(D组)、1μmol/LSIM干预组(A1组)、10μmol/LSIM干预组(A2组)、20μmol/LSIM干预组(h3组)。(3)检测指标:①倒置相差显微镜观察心肌细胞搏动频率;②四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测心肌细胞存活率;③AnnexinV-FITC流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;④荧光染料Fluo-3/AM检测心肌细胞内钙离子荧光强度;⑤Westerblot检测心肌细胞肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)和钙释放通道(RyR2)蛋白表达水平。
结果:①心肌细胞搏动频率:D、A1、A2、A3组心肌细胞搏动频率分别为(35.21±10.17、57.32±6.96、65.16±6.84、70.53±6.20)次/分,与C组(87.74±8.25)次/分相比,搏动频率显著减慢,均P＜0.05;与D组相比,A1、A2、A3组心肌细胞搏动频率显著增快,且呈浓度依赖性,均P＜0.05。②心肌细胞存活率:D、A1、A2、A3组心肌细胞存活率分别为(50.54±3.40)%、(58.75±1.64)%、(72.11±1.77)%、(77.34±4.70)%,与C组(100%)相比,存活率显著下降,均P＜0.05;与D组相比,A1、A2、A3组心肌细胞存活率显著升高,且呈浓度依赖性,均P＜0.05。③凋亡率:D、A1、A2、A3组心肌细胞凋亡率分别为(47.13±2.09)%、(36.64±3.23)%、(26.19±2.49)%、(24.93±2.96)%,与C组(3.02±1.65)%相比,凋亡率显著升高,均P＜0.05;与D组相比,A1、A2、A3组心肌细胞凋亡率显著降低,且呈浓度依赖性,均P＜0.05。④心肌细胞内钙离子荧光强度:D、A1、A2、A3组心肌细胞内钙荧光强度分别为(51.64±3.37)、(33.10±2.57)、(23.37±2.06)、(22.26±1.00),与C组(8.33±0.73)相比,钙荧光强度显著升高,均P＜0.05;与D组相比,A1、A2、A3组心肌细胞内的钙荧光强度显著降低,均P＜0.05;A1组与A2、A3组之间有差异显著性(P＜0.05),而A2组和A3组之间没有差异显著性(P＜0.05)。⑤钙调蛋白的蛋白表达:D、A1、A2、A3组的SERCA2a蛋白表达分别为(0.29±0.09)、(0.38±0.06)、(0.46±0.07)、(0.45±0.03),与C组(0.64±0.05)相比,表达显著下降,均P＜0.05;D、A1、A2、A3组的RyR2蛋白表达分别为(0.19±0.06)、(0.28±0.05)、(0.32±0.07)、(0.41±0.09),与C组(0.67+0.05)相比,表达显著下降,均P＜0.05;与D组相比,A1、A2、A3组SERCA2a和RyR2蛋白表达显著上升(均P＜0.05);A2组和A3组之间SERCA2a蛋白表达没有差异显著性(P＞0.05),而RyR2蛋白表达有显著性差异(P＜0.05)。⑥Ca2+浓度与凋亡率的直线相关性:心肌细胞内的Ca2+浓度与凋亡率呈正相关,相关系数为R=0.95(P＜0.001)。⑦钙调蛋白的蛋白表达与Ca2+浓度的直线相关性:心肌细胞内SERCA2a、RyR2蛋白表达与细胞内Ca2+浓度呈负相关,相关系数分别为R=-0.94和-0.86(均P＜0.001)。⑧钙调蛋白的蛋白表达与凋亡率的直线相关性:心肌细胞SERCA2a、RyR2蛋白表达与凋亡率呈负相关,相关系数分别为R=-0.95和-0.93(均P＜0.001)。
结论:SIM能够显著减少DOX诱导的心肌细胞凋亡,提高心肌细胞存活率。其可能机制在于促进钙调蛋白SERCA2a和RyR2表达的增加,降低细胞内游离钙浓度,减轻心肌细胞内钙超载,从而减少由钙超载所导致的心肌细胞凋亡。