纳米银(Ag NPs)由于其优良的杀菌特性,已经被广泛的应用于生物技术和生命科学领域。已有研究发现纳米银会引起脊椎动物胚胎发育畸形,但很少研究其在动物中引起胚胎发育畸形的分子特性和机制。本实验在前期研究发现纳米银胁迫的斑马鱼胚胎呈现运动功能失调等发育缺陷表型,在此基础上,本研究进行深入的分子缺陷表型的鉴定及其潜在调控机制的研究。首先,通过筛查转录组测序结果,分析发现纳米银胁迫的斑马鱼胚胎中晶状体结构蛋白、神经回路和代谢相关基因呈现下调表达。进一步利用整胚原位杂交技术(whole mount in situ hybridization,WISH)和定量荧光聚合酶链式反应技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RTPCR)检测验证了这些基因的下调表达。同时,本研究分析了纳米银是通过其纳米颗粒和释放的银离子破坏了运动调节神经回路的形成,进而导致了神经细胞的膜电位异常和触碰响应的功能失调及幼鱼运动行为的异常;分析了纳米银特异性诱导胚胎的晶状体而非视网膜发育的缺陷;进一步分析纳米银调控胚胎代谢的分子特征。本研究结果揭示了纳米银胁迫条件下斑马鱼胚胎的眼睛和神经系统发育缺陷及代谢异常的分子特征及其潜在调控机理。主要结果如下:1.纳米银通过破坏斑马鱼胚胎的神经回路进而诱导异常的触碰响应首先,本研究发现纳米银胁迫胚胎的触碰响应和神经元膜电位呈现异常。通过基因芯片技术和生物信息学分析发现,纳米银胁迫的胚胎中神经发生相关基因表达下调。利用q RT-PCR和WISH技术进一步验证了纳米银或银离子处理的胚胎中多巴胺能神经递质基因otpa、sncgb、gad1b、gad2,突触传递基因robo2、vim和glrbb,以及运动神经元基因isl1和isl2a的表达下调。此外,通过在纳米银胁迫处理的胚胎中添加银离子螯合化合物L-半胱氨酸,发现可以恢复gad1b、gad2和isl1的表达降低,暗示纳米银通过其释放银粒子而破坏鱼类胚胎触碰响应的神经环路形成。2.纳米银诱导斑马鱼胚胎的晶状体而非视网膜发育的缺陷通过显微镜观察和苏木素-伊红染色发现纳米银胁迫处理的胚胎晶状体中有裂缝和液泡。此外,通过基因芯片分析及q RT-PCR和WISH技术验证了纳米银胁迫处理的胚胎中不同晶体蛋白基因的下调表达和视网膜基因的表达正常。此外,通过细胞凋亡和m RNA输出检测发现,纳米银胁迫的胚胎晶状体中未观察到明显的细胞凋亡,并且在纳米银胁迫的胚胎晶状体细胞中观察到正常的m RNA输出,暗示纳米银诱导晶状体标记基因的表达下调及其发育缺陷并不是通过破坏m RNA的输出而产生。3.纳米银影响斑马鱼胚胎发育过程中的代谢Microarray分析揭示了纳米银胁迫的斑马鱼胚胎在24 hpf时代谢基因的表达发生改变。通过q RT-PCR和WISH进一步的检测,我们发现了纳米银胁迫的胚胎糖酵解和酪氨酸代谢途径中部分基因在24 hpf时下调表达,随后在72 hpf的胚胎中这些基因的表达却呈现补偿性上调表达。利用标记糖酵解途径代谢产物的Elase试剂盒,我们检测发现,在纳米银胁迫处理的胚胎中观察到糖酵解途径中的己糖激酶和琥珀酸脱氢酶活性降低而丙酮酸含量的增加,这与在进行性肌营养不良患者中观察到的代谢分子特征相似。此外,本研究推测,在纳米银胁迫的胚胎中,糖酵解代谢的变化通过调节糖酵解代谢物的浓度而不是通过诱导躯干肌细胞中的细胞凋亡和增殖,进而影响肌纤维特化发育过程。同时,在纳米银胁迫的胚胎中,酪氨酸代谢的变化可能与神经回路形成缺陷一起共同导致其触碰响应异常。