论文部分内容阅读
目的: 上皮细胞一间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指完全分化的上皮细胞经过表型转化，获得间质细胞特征的生物学过程。越来越多的研究发现，EMT可能是组织器官纤维化的一个重要原因。受损的肺泡上皮细胞发生EMT，转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞，与肺纤维化有密切的关系。促炎症消退介质消退素D1具有抗炎促消退的作用。最新的研究表明，消退素D1在肿瘤细胞的EMT过程中具有一定的抑制作用。然而对于各种诱因引起的肺泡上皮细胞EMT发生发展过程中，消退素D1是否同样具有干预作用缺乏相应的研究。因此，本研究的目的是通过建立TGF-β1诱导的大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT模型，探讨消退素D1对此生物学过程是否具有干预作用。 方法: 1.用胰酶消化、免疫和差时贴壁法分离纯化SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。 2.将培养48小时后的肺泡Ⅱ型上皮细胞随机分成4组:①正常对照组(control，培养基不加任何药物)，②TGF-β1组(TGF-β1，10ng/ml)，③TGF-β1+RvD1组（10ng/ml TGF-β1+100nmol/ml resolvinD1）④溶剂对照组(10ng/ml TGF-β1+0.19 ul/ml alcohol)。 3.药物作用72小时后，显微镜下观察肺泡Ⅱ型上皮细胞形态的改变。 4.用蛋白印迹法(western blot)检测药物作用72h前后肺泡Ⅱ型上皮细胞中上皮细胞标志E-cadherin，间质细胞标志α-SMA蛋白的表达。 5.CCK-8检测药物作用72h后各组细胞的增殖情况。 6.采用SPSS19.0统计软件进行分析，所有数据以均数±标准差((x)±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用Newmankeuls检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.显微镜下观察药物处理72h后肺泡Ⅱ型上皮细胞形态学的改变:正常对照组细胞呈鹅卵石状，细胞连接成片，胞浆内可看到颗粒状物;TGF-β1组细胞形态梭形样改变，与成纤维细胞相似，细胞与细胞连接变得松散，几乎见不到正常的细胞形态;TGF-β1+RvD1组出现梭形细胞与正常细胞共存状态，且梭形细胞形态有所改善，细胞连接较紧密，可见正常细胞形态;TGF-β1+alcohol组细胞形态与TGF-β1组相似。 2.肺泡Ⅱ型上皮细胞E-cadherin蛋白表达量:与正常对照组相比，TGF-β1组与溶剂对照组E-cadherin蛋白表达明显降低(P＜0.05);与TGF-β1组相比，TGF-β1+RvD1组E-cadherin蛋白表达明显升高(P＜0.05)。 3.肺泡Ⅱ型上皮细胞α-SMA蛋白表达量:与正常对照组相比，TGF-β1组与溶剂对照组α-SMA蛋白表达明显升高(P＜0.05);与TGF-β1组相比，TGF-β1+RvD1组α-SMA蛋白表达明显降低(P＜0.05)。 4.药物作用72h后，各组肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖情况比较:与正常对照组相比，其他三组均无明显增殖情况;四组细胞的增殖情况差异无统计学意义。 结论: 1.TGF-β1在一定条件下，可使正常分化的肺泡Ⅱ型上皮细胞发生EMT。 2.RvD1可改善TGF-β1引起的肺泡Ⅱ型上皮细胞向梭形细胞转化的程度，在一定程度上保持细胞间的紧密连接。 3.在肺泡Ⅱ型上皮细胞发生的EMT中，RvD1可上调TGF-β1引起的上皮细胞标志E-cadherin蛋白表达量的降低，并可降低间质细胞标志α-SMA蛋白表达量的升高。RvD1可在一定程度上缓解TGF-β1引起的肺泡Ⅱ型上皮细胞发生的EMT。 4.TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞发生EMT的过程中，并没有引起AT(II)细胞的增殖;RvD1缓解EMT的机制也不是通过抑制增殖实现的。