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磷脂酶D (Phospholipase D, PLD, EC 3.1.4.4)是催化磷脂分子中磷酸二酯键水解和碱基交换的一类酶。据研究报道,PLD不仅作为功能蛋白参与磷脂水解基团的转移,其水解产物如磷脂酸(phosphatidic acid, PA)、二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)、游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)等与信号转导相关,进而参与胁迫应答或发育调控。菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是我国十大传统名花及世界四大切花之一干旱胁迫严重危害菊花的产量与品质。近年,随着分子生物学和生物信息学的发展,菊花中也发掘了多种抗逆基因及转录因子,但多集中在转录因子参与抗逆的调控路径信号的研究。然而,在磷脂酶参与菊花抗逆方面的研究尚未见报道。为此,本研究克隆了CmPLDa基因,分析了其表达特性,通过转基因手段创制了耐旱菊花新种质,为磷脂酶介导菊花胁迫应答分子机理研究奠定基础。主要研究结论如下：1.菊花CmPLDa基因的克隆与序列分析通过简并引物、RT-PCR和RACE方法克隆出切花菊‘神马’的磷脂酶Da基因的全长序列,命名为CmPLDa。序列分析表明：CmPLDa全长2697bp,其中开放阅读框(ORF)长为2427bp,编码809个氨基酸。氨基酸序列比对发现,CmPLDa氨基酸序列存在典型的PLD家族HKD结构域、C2结构域,并且CmPLDa氨基酸序列与已知的磷脂酶D氨基酸序列同源性高达83%-88%。通过构建系统进化树发现,CmPLDa与向日葵HaPLDa的亲缘关系最近,其从属于PLDa家族。2.菊花CmPLDa基因的表达特性分析利用荧光定量的方法分析了CmPLDa的组织表达特性及其在非生物胁迫、脱落酸(ABA)、蚜虫、黑斑病接种处理下的表达特性。结果表明：CmPLDa在根、茎、叶、花等组织均有表达,在茎、叶、花中表达量较高,在根中表达较低；CmPLDa的表达几乎不受低温影响,整体上受机械损伤抑制,受高温明显抑制,受缺磷和蚜虫接种显著诱导,干旱和盐胁迫诱导了胁迫后期CmPLDa的增加,CmPLDa受ABA处理快速诱导；黑斑病菌接种也可诱导CmPLDa的表达。由此可知,CmPLDa可能参与了菊花多种胁迫过程,包括温度、干旱、缺磷、ABA信号、蚜虫及黑斑病等。3.菊花CmPLDa基因的遗传转化研究构建CmPLDa基因的正义表达载体和反义表达载体,利用农杆菌介导法进行菊花CmPLDa基因遗传转化。经PCR和qRT-PCR检测,筛选出正反义转基因株系Z1、Z2和Fl、F2。对转基因株系进行20% PEG6000模拟干旱胁迫处理以鉴定其抗旱性。结果表明,正义株系植株在干旱胁迫后其存活率为野生型的1.7至1.8倍,耐旱性增强。正义株系相对含水量高于对照近10%,电导率及MDA含量则显著低于野生型,说明正义株系细胞膜完整度及稳定性高于野生型。转基因反义株系F1、F2大部分植株萎蔫皱缩,萎蔫指数分别为5和6,恢复生长后存活率低于野生型。反义株系则比正义株系的含水量要低,电导率及MDA含量明显高于野生型和反义株系.干旱胁迫下,转基因正义株系ABA含量是野生型的1.3倍、1.22倍,反义株系ABA含量约为野生型的0.83、0.81。推测水分胁迫下ABA参与诱导气孔关闭,进而减少水分的丧失。综上所述,通过转基因获得了耐旱性新种质,CmPLDa基因可以维持膜的稳定性及通过ABA介导菊花抗旱性。