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季节性流感和大流行给人类的健康带来巨大威胁。流感病毒是单股负链RNA病毒,属于正粘科,分为三种类型,其中A型流感最为广泛,危害最大。流感病毒表面血凝素(HA)分子是主要抗原,三维结构为三聚体结构,52-277位保守的半胱氨酸将血凝素分子分为一个球状头部和杆状茎部两部分。HA球头部含有唾液酸受体结合位点,介导病毒与受体细胞的结合,是诱导机体产生中和抗体的主要靶标。不同亚型HA头部结构域氨基酸不同,高度可变,针对HA球头部的抗体特异性较强。HA杆状茎部在所有HA亚型中相对保守,可诱导产生广谱中和抗体,但由于茎部抗原表位的暴露较差,该类抗体的制备和筛选较为困难。目前广谱中和抗体的研究与制备是流感抗体研究中的热点。然而,传统的血凝抑制与微量中和实验很难快速筛选检测出针对HA茎部保守区域的抗体。利用反向遗传技术,制备含有不同HA头部和茎部的重组荧光报告流感病毒,通过头茎互换HA流感荧光报告病毒的次序筛选,将能快速筛选得到针对保守茎部的广谱中和抗体。前期我们实验室成功拯救出一株携带Gaussia.luciferase荧光报告基因的流感病毒,命名为IAV-luc。IAV-luc是复制完全型病毒,能够在感染的细胞和动物体内稳定表达荧光素酶。通过荧光素酶的检测,能够直观、快速的检测报告病毒的复制情况。本研究尝试在IAV-luc背景下拯救携带不同亚型头茎互换的HA荧光报告病毒,利用HA头茎互换荧光流感病毒靶向HA茎部结构域,开发一种高效、便捷、灵敏的高通量广谱中和抗体筛选方法。本研究中,成功拯救出一系列的荧光流感病毒 H1-PR8/H1-CA09-luci,H1-PR8/H5-HK-luci,H9-HK/H1-PR8-luci,H1-CA09/H1-PR8-Luci,将头茎互换荧光流感病毒与待测抗体孵育后,将混合液转移至细胞培养板,培养24h后加入腔肠素底物检测报告病毒的荧光素酶的活性。荧光素酶活性的强弱直接反映出待检测抗体对报告病毒的抑制程度,我们可以判断出待检抗体的结合部位及中和活性。本研究初步使用已知中和抗体4E6、CR9114、C179、8852等验证头茎互换荧光流感病毒的识别能力。结果显示,4E6只能中和 H5-HK-luci,不能中和 H1-PR8/H5-HK-luci,而 CR9114、C179、8852对 H1-PR8-luci、H5-HK97-luci、H1-PR8/H5-HK 有中和活性,证实了 4E6 抗体识别H5-HA的头部,CR9114、C179和8852则是识别茎部的广谱中和抗体。综上,本研究建立一种通过HA头茎互换荧光报告流感病毒快速检测茎部中和抗体的实验方法。该方法首次将荧光素酶基团引入头茎互换流感病毒中,大大提高针对HA茎部的广谱中和抗体检测的效率和灵敏度,为高通量筛选广谱流感中和抗体提供可行的方案,为流感病毒的防治与流行病学调查提供新的思路。