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目的:神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是神经系统发育过程中特殊的细胞群,是能够在适当的微环境中分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的一类多能干细胞。由于神经干细胞具有自我更新和多分化潜能的特性,因此神经干细胞具有重大的医学研究价值和应用前景。本实验研究目的就是在本实验室建立稳定的、标准化的神经干细胞的体外培养方法,探讨C6胶质瘤细胞诱导神经干细胞分化的影响,并对其调控机制进行初步探索。本实验将为神经干细胞的分化及其调控机制奠定实验基础。材料与方法:本研究首先建立大鼠神经干细胞的培养方法:选取孕龄17-18天Wistar大鼠,体式显微镜下,无菌取胎鼠脑纹状体组织,采用机械吹打和胰酶消化方法将组织块制备成单细胞悬液,神经干细胞专用培养基（Neuralbasal medium,NB）（含EGF40ng/ml、2%B27等成分）,37℃、5%CO2孵育培养。观察光镜下细胞生长及自然分化特征。并采用免疫荧光检测巢蛋白（Nestin）、β-tubulinⅢ、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及少突胶质细胞标志物（O4）的表达。C6胶质瘤细胞采用含10%胎牛血清RPMI1640培养,当细胞生长至80%融合度时,培养液更换为无血清的RPMI1640培养液,24小时后获取C6胶质瘤细胞培养上清。将培养的神经干细胞分为两组:①对照组:采用NB/RPMI1640（1:1,无EGF）;②处理组:采用NB/C6细胞培养上清（1:1,无EGF）。光镜观察不同时相（1d、3d、5d）神经干细胞的分化,并采用RT-PCR、Western-blotting和免疫荧光法检测细胞微管相关蛋白MAP-2的表达。同时,采用RT-PCR在mRNA水平上检测转录调控因子Neurogenin3（Ngn3）、NeuroD及NeuroD2在神经干细胞不同分化时相的表达水平,对其调控机制进行了初步探索。结果:体外NSCs以神经干细胞球（neurosphere）的形式增殖并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞,并能分化为神经元细胞（β-tubulinⅢ染色阳性细胞）、星形细胞（GFAP染色阳性细胞）和少突胶质细胞（O4染色阳性细胞）。实验中分别观察第1、3、5天两组NSCs的分化细胞MAP-2的表达情况:与对照组比较,第1天未见明显差别,于第3天MAP-2在mRNA表达水平出现差异,第5天可见mRNA及蛋白表达水平均表现显著差异,且免疫荧光染色可见更多的MAP-2阳性细胞。同时检测发现转录因子Ngn3、NeuroD、NeuroD2的mRNA表达水平的变化趋势与之一致。结论:本研究成功建立大鼠神经干细胞的体外培养体系,可以维持神经干细胞保持高度增殖及不发生自我分化的特性。与神经干细胞的自我分化比较,C6胶质瘤细胞培养上清可诱导神经干细胞向神经元分化,该作用可能是通过上调bHLH家族转录因子Ngn3、NeuroD、NeuroD2三者的表达实现的。由此推测,C6胶质瘤细胞可分泌某种因子通过bHLH家族转录因子调控机制诱导神经干细胞向神经元分化,为下一步研究神经干细胞的分化调控及其与神经胶质瘤的起源的相关性奠定了实验基础。