单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是重要的人兽共患李斯特菌病的病原菌,能引起脑膜炎、胃肠炎、败血症及流产等症状,死亡率高达20%-30%,是致死率最高的食源性病原菌。动物李斯特菌病主要与动物食用污染的贮存饲料有关。该菌通过污染农场和经食品加工环节传染给人。李斯特菌病在欧美国家曾多次暴发流行,其中不少为动物制品污染Lm所致。我国也有Lm在畜禽和人之间引起暴发的报道。Lm对人类健康造成极大的威胁,已引起世界各国的高度重视。本研究对华东地区食品中Lm污染状况进行了调查,并对分离和收集的食品源、动物源和人源菌株进行基于多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)的遗传进化分析,以及基于毒力基因及毒力相关基因的遗传谱系分析和多毒力位点序列分型(Multi-Virulence-Locus Sequence Typing, MVLST)分析,根据以上菌株的分离背景,结合小鼠感染实验,对引起李斯特菌病的临床分离株和食品源分离株的种群结构、毒力进化及侵袭力进行了研究。1食品中单核细胞增生性李斯特菌的分离和鉴定对华东地区11个城市的猪肉、鸡肉、牛肉、海产品、RTE和蔬菜共六类食品进行了Lm的分离和鉴定。对采集的样品先用LEB培养基进行选择性增菌,再用科马嘉李斯特菌显色培养基进行鉴别,将分离获得的可疑细菌利用多重PCR进行李斯特菌属和种的鉴定,最后以鉴定血清型的多重PCR和Lm李斯特菌诊断血清联合使用确定Lm的血清型。在采集的11个城市的538份样品中,共分离到93株Lm、150株无害李斯特菌(L.innocua)和4株威氏李斯特菌(L.welshimer)。Lm分离率为17.29%,其中包括46株血清型为1/2a的菌株、16株血清型为1/2b的菌株、30株血清型为1/2c的菌株和1株血清型为4b的菌株。对六大类食品的Lm分离结果表明,华东地区11个城市食品中Lm分离率较高,Lm分离株的优势血清型为1/2a,1/2b和1/2c；冷冻和冷鲜样品中的Lm分离率明显高于常温下的样品(P<0.05)；此外,猪肉、鸡肉和牛肉等生肉中Lm分离率较高,生肉及冷冻和冷鲜食品中Lm分离率高于常温贮存的样品。华东地区食品中的李斯特菌分离结果显示,食品中存在一定程度的Lm的污染,对食品安全造成了威胁,食品加工、流通和销售环节的监控有待加强。2不同来源单核细胞增生性李斯特菌分离株的MLST分型研究MLST是一种基于多个管家基因序列的分型方法,适合进行种群结构分析和进化分析。为了研究不同分离来源和不同血清型菌株的种群结构,本研究对分离的Lm菌株进行了MLST分型,绘制了最小生成树(Minimum spanning tree)。MLST结果显示,64株菌株分为25个ST型,其中ST618、ST619和ST626为新申请的ST型。ST型与血清型有较高的相关性,大多数ST型对应一个血清型,如ST3、ST5和ST87型；也有一个ST型对应多个血清型,如ST1、ST3和ST9等包含多个血清型。此外,出现了3个克隆复合群(Clonal complex, CC)CC1、CC3和CC9,这三个克隆复合群在其他国家和地区也广泛分布。另外,人和动物源分离株分布在多个ST型中,其中多株人源株分离株分布在CC9中。CC9中也包括许多食品源分离株。从进化距离可以看出,血清型1/2a和1/2c,血清型1/2b与4b、4d、4e间分别存在较近的遗传关系。血清型1/2b与4b间出现“间隔式”进化,而血清型1/2a和1/2c间则出现“递进型”进化。总之,通过MLST分型,了解了食品源分离株的ST型分布,发现不同来源菌株中某些占优势的ST或CC,研究了不同血清型的进化关系。3基于毒力及毒力相关基因序列的分子亚分型研究本研究基于毒力基因actA的3’端高度变异的序列,对食品源、动物源和人源分离株进行了遗传谱系(lineage)分析。结果表明,把Lm分离株共分为了四个谱系,其中绝多数分离株属于lineage Ⅰ和lineage Ⅱ。Lineage Ⅰ主要包括血清型1/2b、4b和部分4d、4e菌株。Lineage Ⅱ主要包括血清型1/2a和1/2c菌株。血清型4b菌株分布在lineage Ⅰ、Ⅲ和IV中。四个谱系的菌株在生态学、遗传学和表型特征上有明显差异,与Lm在食品中的传播能力和致病性有着密切的关系。MLST由于管家基因的保守性,不适合局部流行病学研究,对某些血清型分辨力不足。因此利用基于毒力基因的MVLST和小鼠感染实验进一步研究了菌株的毒力基因进化和毒力潜能。通过MVLST分析发现,血清型4b和1/2b的菌株分别属于两个不同的簇(Cluster) Cluster A和Cluster B。血清型4b菌株又分为两个亚簇,其中一个亚簇由多株人源和动物源临床菌株构成,除血清型4b菌株之外,还包括血清型4d、4e、3b和1/2b的菌株；另一个血清型4b亚簇全部由血清型4b的菌株构成,但多为食品源分离株。血清型1/2a和1/2c菌株在MVLST中仍未完全分开,表明两种血清型具有高度同源性。通过MVLST分型表明不同血清型已经出现不同的毒力基因特征,而各血清型内部也有不同的毒力基因特征。选取部分Lm菌株以尾静脉注射途径进行的小鼠感染实验表明,不同血清型菌株的侵袭能力不同,对内脏器官造成的病理变化程度也不同,其中血清型1/2a的菌株侵袭能力最强,1/2c的菌株次之,血清型1/2a的菌株与1/2b和4b菌株的侵袭能力呈现显著性差异(P<0.05)。从不同角度进行的三种分子亚分型的实验结果显示了血清抗原相关基因、管家基因、和毒力及毒力相关基因在某种程度上呈现进化一致性。综上所述,本研究对华东地区食品中Lm污染情况进行了调查,通过MLST分型研究了不同来源分离株的种系进化,发现了食品和临床菌株中的流行ST型或克隆复合群,并通过对毒力及毒力相关基因的研究了解其种群结构和毒力进化,发现不同血清型及同一血清型内部出现不同毒力基因特征。本研究对李斯特菌病的预测监控、风险评估和预警提供新技术基础和新认识,对于李斯特菌病的预防控制具有重要公共卫生意义。