近年来,随着抗生素滥用情况的日益严重,由耐药菌引起的严重感染性创面逐渐增多,临床缺乏有效的治疗手段。由于此类创面愈合的病程长、并发症多,严重影响了患者的健康和生活质量,给社会带来巨大负担。中国传统中药?“五谷虫”,为丽蝇科丝光绿蝇、大头金蝇的幼虫。《本草纲目》、《本草求原》均记载:该虫性寒无毒,可搽敷外用,能治疗臁疮等外科疾病。五谷虫疗法,是近年来兴起的有效治疗耐药菌引起的严重感染创面的新型生物治疗方法,即临床上应用活体无菌丽蝇科丝光绿蝇幼虫,来治疗耐药菌感染创面,已取得满意效果,其作用机制主要包括:生物清创、抗菌和促进创面愈合。本课题组前期研究已经证实,五谷虫对感染创面起到抗菌作用的有效成分为具有生物活性的抗菌肽类蛋白。但是目前对五谷虫促进创面愈合作用有效成分的功能学研究尚无报道,仍存在以下尚未解决的问题:(1)目前国际上应用活体五谷虫生物清创的同时,利用活体五谷虫分泌的活性成分,控制创面的细菌感染;而我国传统医学记载五谷虫作为一种中药,经过炮制后,使用其干粉外敷,同样可以促进创面的愈合。但是尚缺乏活体五谷虫有效成分和五谷虫干粉的比较研究;(2)皮肤创面愈合病理过程复杂,涉及修复细胞的迁移、创面血管生成和局部神经再生等多个过程。关于五谷虫有效成分对上述愈合过程的影响机制尚不清楚;(3)五谷虫在中药学作为一种动物中药,其成分复杂,大多为大分子化合物,分离分析难度较大,这大大的限制了五谷虫干粉在临床上的应用,远远落后于临床上对活体五谷虫的应用。因此,对待动物药,必须在理论和方法上有所创新,研究和开发其有效成分。为了解决以上几个问题,本课题从多种五谷虫有效成分获取方式出发,采用组织形态学、药物化学、药物分析及分子生物学方法,比较了五谷虫有效成分不同获取方式对创面愈合过程的影响,并对其有效组分进行提取、分析,寻找五谷虫对创面愈合有促进作用的有效成分,并明确其作用机制以及可能参与的信号转导通路。本课题研究分三个部分:(1)五谷虫成分不同获取方式对创面愈合作用的比较研究;(2)活体五谷虫成分对创面愈合的促进作用及其机制研究;(3)中药五谷虫脂肪酸组分对创面愈合的促进作用及其机制研究。?1.五谷虫成分不同获取方式对创面愈合作用的比较研究?本部分选用了活体五谷虫的匀浆产物和中药五谷虫干粉为研究对象,对比两种使用方法对大鼠皮肤创面愈合过程的影响,结果发现:创伤后第1和第3天五谷虫匀浆物组、五谷虫干粉组和对照组创面愈合率无显著性差异(P>0.05);创伤后第7,10和14天五谷虫匀浆物组和五谷虫干粉组的创面愈合率高于对照组(P<0.05),五谷虫匀浆物组和五谷虫干粉组创面愈合率无显著性差异(P>0.05)。组织学观察显示:在创面修复过程中,匀浆物组、干粉组与对照组相比,肉芽组织成熟,血管垂直于创面生长,胶原纤维排列整齐,瘢痕窄,成纵行条带,可见再生的皮肤附属器,再生上皮厚,爬行距离远。因此,活体五谷虫匀浆物和中药五谷虫干粉都可以减少大鼠皮肤创面的愈合时间、提高创面的愈合率和愈合质量。?2.活体五谷虫成分对创面愈合的促进作用及其机制研究?(1)五谷虫分泌物对血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制研究本实验部分以活体五谷虫的分泌物(ES)为研究对象,应用体外创面愈合模型,研究分泌物对人微血管内皮细胞系(HMEC-1)迁移和增殖的影响,以及参与的信号通路。MTT法检测ES对内皮细胞活力的影响,结果显示:虽然在10μg/ml ES下,内皮细胞活力最大,但不同浓度ES对细胞活力无明显影响(P>0.05);进一步应用体外创面愈合模型和Transwell法,结果显示:10μg/ml ES可促进内皮细胞迁移;应用Western-blot技术结果表明,ES可以诱导HMEC-1细胞发生迁移,并且时间依赖性激活AKT1,而不是ERK1/2。另外,应用PI3K抑制剂LY294002,可以部分降低ES诱导的细胞迁移,完全地抑制ES诱导的AKT1激活。因此,ES对人微血管内HMEC-1的迁移具有促进作用,而对增殖无影响;ES诱导HMEC-1的迁移作用,主要是激活PI3K/AKT1通路,而非ERK1/2 MAPK通路。(2)五谷虫匀浆物对创面神经再生的影响本实验部分以活体五谷虫的匀浆物作为研究对象,研究五谷虫的匀浆物对大鼠皮肤创面P物质(SP)分泌和蛋白基因产物9.5(PGP9.5)表达的影响,进而探讨五谷虫匀浆物促进创面愈合的机制及它对创面神经再生的影响。免疫组织化学结果显示:创伤后第3,7和10天,五谷虫匀浆物组SP表达的面积、平均光密度和积分光密度均高于对照组(P<0.05);创伤后第7和10天,PGP9.5表达在再生神经中,五谷虫匀浆物组表达多于对照组(P<0.05),创伤后第14天,五谷虫匀浆物组内真皮浅层仍见PGP9.5表达在再生神经中,而对照组未见表达。因此,活体五谷虫匀浆物可以促进创面SP和PGP9.5的表达,并且可能通过促进大鼠皮肤创面神经再生,进而促进创面愈合。3.中药五谷虫脂肪酸组分对创面愈合的促进作用及其机制研究?本部分应用药物化学提纯方法,提取五谷虫干粉中的脂肪酸成分,应用大鼠创面愈合模型,明确该脂肪酸提取物与创面愈合和血管生成之间的关系,寻找五谷虫的有效成分组。结果显示:创伤后第7天和第10天,五谷虫提取物可提高创面愈合率(P<0.05);免疫组织化学显示:创伤后第3天,五谷虫提取物可促进创面微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达(P<0.05);RT-PCR和Western-blot显示:创伤后第3天,五谷虫提取物可促进VEGFA基因和蛋白的表达(P<0.05)。应用气相色谱—质谱(GC-MS)分析,该脂肪酸提取物中共含有10种不同种类脂肪酸,且饱和脂肪酸:单不饱和脂肪酸:多不饱和脂肪酸为:20.57%:60.32%:19.11%。因此,中药五谷虫脂肪酸提取物通过促进大鼠皮肤创面血管生成,进而促进创面愈合。