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哺乳动物卵母细胞成熟要经历多个阶段有序而精细的事件,其分子调控是生命科学研究的重要课题之一。近年来对于调节卵母细胞成熟的相关蛋白的研究取得了许多进展。Aurora激酶是广泛分布在真核生物体内的丝/苏氨酸蛋白激酶家族,参与细胞有丝分裂的调控。Aurora激酶家族在哺乳动物主要有3个成员,分别为Aurora-A、-B和-C。它们具有相似的序列结构,C末端催化序列区域高度保守,而N末端长度和序列均差异较大;其余部分序列没有保守性,因此这3种激酶在亚细胞定位、作用方式和活化底物等方面都不相同。Aurora-A主要分布在中心体和纺锤体附近,在有丝分裂中Aurora-A可调控中心体的成熟与分离,并调控有丝分裂启动、分裂中期染色体排列、纺锤体组装和胞质分裂等环节。减数分裂过程中的纺锤体组装、染色体排列和分离与有丝分裂有较大的差异,研究Aurora-A对猪卵母细胞减数分裂的调控,可加深对卵母细胞减数分裂调控规律的了解,对于揭示哺乳动物生殖规律,提高卵母细胞成熟率,都具有重要的理论意义和实用价值。目前,对于Aurora-A调控低等动物(如非洲爪蟾、果蝇等)卵母细胞成熟分裂进程和相关信号通路的研究虽已取得一些成果,但Aurora-A在哺乳动物卵母细胞减数分裂过程中的功能与机制研究相对较少。已有的报道也主要集中在小鼠和牛卵母细胞上,有关猪卵母细胞减数分裂过程中Aurora-A的功能与机制尚有许多不明之处。本研究采用体外成熟培养、western blot和免疫荧光染色技术,检测猪卵母细胞成数分裂过程中Aurora-A的动态表达和亚细胞定位;在此基础上,通过应用Aurora-A特异性抑制剂MLN8054进行处理,分析Aurora-A对猪卵母细胞成熟和其下游蛋白TACC3磷酸化表达的影响,以期揭示Aurora-A调控猪卵母细胞减数分裂的可能信号通路,为深入了解猪卵母细胞成熟的分子调控机理奠定基础。研究结果如下:1.猪卵母细胞成熟分裂过程中Aurora-A蛋白表达水平的变化收集减数分裂各个时期卵母细胞,应用免疫印迹对卵母细胞中Aurora-A蛋白表达进行检测,观察到Aurora-A蛋白在减数分裂各时间段均有表达,且生发泡期(germinal vesicle,GV期)蛋白表达量最高,之后表达量持续降低;44h后有所升高,但表达量仍显著低于Oh(GV期)。2.猪卵母细胞成熟分裂过程中Aurora-A与α-tubulin的共定位用免疫荧光对采集的各时期卵母细胞染色,可见Aurora-A主要富集在GV期卵母细胞染色体周围,均匀分布在生发泡中;生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)后,Aurora-A则主要伴随纺锤体的组装而表达,并随着纺锤体的迁移而迁移,且其富集位置与纺锤体大致重叠;到MII期,Aurora-A则在排出的pbI以及卵母细胞内纺锤体上均有富集。3.MLN8054对猪卵母细胞成熟和减数分裂进程的影响用Aurora-A特异性抑制剂MLN8054处理后,卵母细胞卵丘扩散和成熟受到明显抑制;阻滞在Pro-MI期卵母细胞显著增加(P<0.05),而阻滞在MI期以及AI-TI期的卵母细胞则显著降低(P<0.05),且当MLN8054浓度达到5 μM时,已未发现有处于AI-TI期的卵母细胞。4.MLN8054对猪卵母细胞纺锤体组装和染色体排列的影响MLN8054处理后的猪卵母细胞纺锤体、染色体形态结构变化,统计形态异常率。对照组纺锤体,大多呈现规则典型的猪卵母细胞纺锤体状,并且染色体排列在纺锤体赤道板上;而处理组卵母细胞的纺锤体则大多呈现为排列不规则,甚至无纺锤体出现等各种异常情况,染色体也随之无规律的排列。5.抑制猪卵母细胞Aurora-A活性对孤雌胚胎发育的影响用MLN8054抑制猪卵母细胞Aurora-A活性,与对照组相比,各组的卵裂率均未有显著降低,但呈逐渐减少的趋势;囊胚发育率在3和5μM/mL MLN8054时显著下降;表明Aurora-A受到抑制后,孤雌胚胎的发育潜能亦受到明显抑制。6.MLN8054 对 p-Aurora-A 表达的影响与对照组相比,用抑制剂MLN8054处理猪卵母细胞后,处理组卵母细胞中p-Aurora-A蛋白表达量显著降低。p-Aurora-A/GAPDH相对表达强度为0.36/1,差异显著(P<0.05)。7.猪卵母细胞Aurora-A活性抑制对TACC3磷酸化表达和定位的影响p-TACC3在减数分裂各个时期均有表达,Aurora-A抑制后,减数分裂各个时期p-TACC3表达明显下降,且20h蛋白表达降低最明显;p-TACC3与α-tubulin共定位结果显示,在对照组卵母细胞中,p-TACC3的荧光信号部分与α-tubulin重合,部分在α-tubulin周围,分布的面积超过α-tubulin,而Aurora-A活性抑制后,p-TACC3分布明显减少,纺锤体极处的p-TACC3表达消失,而纺锤体的大小也有所变化。