头顶一颗珠为百合科(Liliaceae)延龄草属植物延龄草Trililmu tschonoskii Maxim.的干燥根及根茎。本课题采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技术对头顶一颗珠中的化学成分进行定性分析,建立了药材中3个主要皂苷类成分的HPLC含量测定方法;通过提取分离制备了头顶一颗珠甾体皂苷,并对其中的主要皂苷类成分进行了化学分离和结构鉴定;在化学研究的基础上,利用神经行为学、核磁共振成像、组织病理学及分子生物学技术研究头顶一颗珠甾体皂苷抗脑缺血药理作用,并从Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子的表达探讨其分子机制。主要包括两个部分的研究:第一部分:头顶一颗珠化学研究目的:定性和定量分析头顶一颗珠药材中的主要甾体皂苷类成分;制备头顶一颗珠甾体皂苷,分离、鉴定其中的主要成分。方法:采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技术快速指认头顶一颗珠药材中的甾体皂苷类成分;采用HPLC-DAD技术建立药材中重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ和偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-[O-α-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷(PRRG)3个皂苷类成分的含量测定方法:Angilent Poroshell C18 色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.7 m),乙腈-水为流动相梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,检测波长203nm。采用700%乙醇回流、正丁醇萃取和D101大孔树脂纯化,制备头顶一颗珠甾体皂苷,通过硅胶柱色谱对甾体皂苷进行化学分离,根据波谱数据鉴定化合物结构;应用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术,通过对照品比对和化合物裂解规律指认头顶一颗珠甾体皂苷中的主要成分。结果:指认了头顶一颗珠药材中的27个化学成分,其中23个为甾体皂苷类成分;含量测定结果表明,重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ和PRRG色谱峰分离度良好,标准曲线在线性范围内相关性符合要求(r≥0.9997),平均加样回收率为97%～103%,RSD值为0.5700～3.61%,对11批头顶一颗珠药材的含量测定结果显示,3种成分在各批次药材中有较大差异。从药材中分离、富集了头顶一颗珠甾体皂苷,分离、鉴定了其中的4个单体成分,分别为重楼皂苷Ⅵ,重楼皂苷Ⅶ,偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1 →4)-[O-α-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷(PRRG)和偏诺皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖苷。高分辨液质联用分析表明,头顶一颗珠甾体皂苷中主要含有7个皂苷类成分,分别为:重楼皂苷Ⅶ(1)、PRRG(2)、重楼皂苷Ⅵ(3)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-β-D-葡萄糖苷(4)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-β-D-葡萄糖苷(5)、偏诺皂苷元-3-0-β-D-葡萄糖苷(6)和重楼皂苷V(7)。结论:通过定性分析,明确了头顶一颗珠药材中主要含有甾体皂苷类成分;所建立的HPLC含量测定方法简便、稳定、可靠,可用于该药材和提取物的质量控制。实验制备的头顶一颗珠甾体皂苷主要含有7个甾体皂苷类成分,包括6个偏诺皂苷类化合物和1个薯蓣皂苷类化合物;该部分实验为头顶一颗珠药材的质量控制和药效学研究奠定了基础。第二部分:头顶一颗珠抗脑缺血药理研究目的:观察头顶一颗珠甾体皂苷对中动脉栓塞大鼠神经行为学、神经病理学以及脑组织神经血管单元超微结构的影响,并进一步从Wnt/β-Catenin信号通路关键信号分子的表达探讨头顶一颗珠甾体皂苷抗脑缺血作用的分子机制。方法:采用中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)方法制备大鼠局灶性脑缺血模型。SD大鼠随机分为假手术组、模型组、头顶一颗珠甾体皂苷(TSTT)三个剂量组(130、65、33mg/kg)以及阳性药金纳多60mg/kg组。各给药组大鼠于脑缺血手术后6小时灌胃给药,假手术组、模型组灌胃给予等容量生理盐水,每天灌胃1次,连续给药15天进行指标检测。Bederson评分法及横木行走实验评价肢体运动功能的缺损。T2加权成像(T2-weighted imaging,T2WI)结合T2WI图像检测脑缺血大鼠脑梗死体积;T2 mapping成像获取T2弛豫时间,定量分析脑缺血大鼠不同脑区的损伤;三维时间飞跃(Three dimensional time of flight,3D-TOF)磁共振血管成像(Magnetic resonance angiography,MRA)观察脑缺血后中动脉闭塞情况.,定量分析血管信号强度;三维动脉自旋标记技术(Three dimensional arterial spin labeling,3D-ASL)检测脑血流量(Cerebralblood flow,CBF)变化。HE染色观察脑缺血大鼠病理学损伤;免疫组化染色结合图像分析技术检测轴突损伤标记蛋白APP的表达;免疫荧光染色结合图像分析技术检测新生细胞增殖标记蛋白Ki67、新生神经元迁移的标记蛋白DCX的表达;免疫荧光双标染色技术检测GFAP+/Ki67+、NeuN+/Ki67+阳性神经细胞,分析新生细胞向星形胶质细胞和神经元的分化,综合评价头顶一颗珠甾体皂苷对脑缺血大鼠神经病理损伤及新生细胞增殖、迁移、分化的影响。透射电镜观察缺血梗死灶周围皮层组织神经元、星形胶质细胞、血管、轴索髓鞘、突触以及线粒体的超微结构,评价头顶一颗珠甾体皂苷对脑缺血大鼠神经血管单元超微结构的保护作用。RT-PCR技术定量分析脑缺血15天大鼠皮层Wnt3a、β-catenin、GSK-3α、GSK-3ββ、Dishevelled 3 和 CRMP 2 的转录表达;Western Blot 技术定量分析 W nt3a、Dishevelled 3、β-catenin 及 P-β-catenin Ser33/37Thr41、GSK-3α及 P-GSK3α Se r21/Tyr279、GSK-3β及 P-GSK3ββ Ser9/Tyr216 和 CRMP 2 及 P-CRMP2 Thr514 的蛋白表达,分析头顶一颗珠甾体皂苷对Wnt/β-catenin通路关键信号分子的调控作用。结果:Kaplan-Meier生存分析结果显示,TSTT 65 mg/kg可提高局灶性脑缺血15天大鼠存活率(P<0.05)。和模型组相比,TSTT 65 mg/kg可明显改善脑缺血大鼠神经行为学缺损症状(P<0.01或P<0.05),降低脑缺血梗死体积(P<0.01),减轻缺血脑区顶叶皮层、纹状体rT2值(<0.05),增强基底动脉及右侧前动脉血管信号强度(P<0.05),提高顶叶皮层、纹状体rCBF(P<0.01或P<0.05)。病理学检测结果显示,TSTT 65 mg/kg可减轻局灶性脑缺血大鼠神经元变性程度;下调灰质脑区皮层、丘脑、纹状体及白质脑区外囊、内囊等部位APP表达;上调DCX蛋白在纹状体表达,增加缺血脑区侧脑室及纹状体Ki67阳性细胞数;差异较模型组具有显著性(P<0.01或P<0.05)。透射电镜观察结果显示:和模型组相比,TSTT130、65、33mg/kg给药可不同程度减轻脑缺血大鼠神经血管单元微结构损伤;降低轴突与髓鞘外径/内径比值(P<0.01);增加皮层突触数量,提高PSD厚度,减小突触间隙(P<0.01),降低线粒体损伤评分(P<0.01);TSTT 130、65 mg/kg还能增加PSD长度,与模型组比较均具有统计学差异(P<0.01)。Wnt/β-Catenin信号通路关键分子检测结果显示:TSTT 65 mg/kg组大鼠Wnt3a mRNA、蛋白表达较模型组明显上调(P<0.01或P<0.05);TSTT33 mg/kg也可明显增加局灶性脑缺血大鼠Wnt3a蛋白表达(P<0.05),与模型组比较差异明显。β-c.atenin结果显示,TSTT 65 mg/kg可明显上调中动脉栓塞大鼠β-catenin mRNA,总蛋白表达及下调P-β-catenin Ser33/37Thr41蛋白表达;TSTT 130 mg/kg可上调β-catenin mRNA 表达、TSTT 130、33 mg/kg 可下调 P-β-catenin Ser33/37Thr41蛋白的表达,差异较模型组具有显著性(P<0.05)。Dishevelled 3检测结果显示,TSTT 65、33 mg/kg 可明显上调 Dishevelled 3 mRNA、蛋白表达;TSTT 130 mg/kg也可提高Dishevelled 3蛋白表达,差异较模型组显著(P<0.01或P<0.05)。GSK-3 结果显示,TSTT 65 mg/kg 可明显下调 GSK-3α mRNA 和 GSK-3ββ mRNA表达,上调 P-GSK3α/ββ Ser21/9 蛋白的表达;TSTT 130、33 mg/kg 可降低 GSK-3ββmRNA表达,与模型组比较差异明显(P<0.01或P<0.05)。CRMP2 结果显示,TSTT 65 mg/kg 可上调 CRMP2 mRNA 表达;TSTT 65、33 mg/kg 可上调 CRMP2 蛋白,下调 P-CRMP2 Thr514 蛋白表达;TSTT 130 mg/kg可下调P-CRMP2 Thr514蛋白表达,差异较模型组具有显著性(P<0.01或P<0.05)。结论:头顶一颗珠甾体皂苷可减轻中动脉栓塞致局灶性脑缺血大鼠组织损伤;改善神经病理学及神经血管单元微结构改变;增加缺血脑区血流灌注;并通过调控Wnt/β-catenin通路关键信号分子的转录及翻译促进脑缺血后神经发生,促进神经功能的重塑。