目的：　　 人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus,HIV)是严重危害人类健康和生命的病毒,是引起获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficieney syndrome,AIDS)的病原体。HIV被发现后的20多年以来,人们一直致力于疫苗研发,目前虽然己有70多种疫苗获准进入临床实验[1],但仍未取得根本性突破,主要原因在于目前人们对于病毒与宿主免疫系统相互作用的过程缺乏完整认识,未能全面揭示HIV-1特异性免疫应答与病毒遗传进化的内在关系。许多资料表明,针对HIV的早期调控蛋向Nef的免疫应答,在抗HIV-1的感染中可能有重要的保护作用。Nef蛋白已经正在成为艾滋病疫苗研究的重要靶点[2,3,4]。　　 HIV-1调节因子Nef是一个27-29kDa的N末端豆蔻酰化的蛋白质,它对人体内病毒复制和AIDS的发病机制起到重要作用[5-9]。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)应答在控制病毒复制形成病毒调定点方面的作用,受到多数研究者的认同,对新发/急性感染者体内病毒特异性CTL应答与病毒进化规律的研究能揭示感染者感染早期CTL应答对病毒的选择作用及其差异,对于探索保护性免疫应答有重要启示。　　 在宿主免疫压力下,病毒一方面通过Nef蛋白降低感染细胞表面MHC-1类分子表达,来减弱免疫细胞的识别和杀伤功能[10],一方面通过Nef基因快速变异来逃避CTL,应答。HIV-1 nef基因是病毒毒性的主要决定因素之一,其变异程度很大程度上受到其功能的限制。Nef基因在所有灵长类慢病毒如HIV-1、HIV-2和SIV中相对保守[11],nef缺失或显著的不正常是很少见的[12]。　　 目前,已有的研究大多对HIV-1长期不进展者的Nef蛋白进行了研究,对新发/急性感染者的研究很少,且研究结果存在争议。目前公认病毒调定点(setpoint点)决定感染者的预后,而CTL应答又是影响setpoint的重要因素,nef区是CTL应答的重要靶位,对不同调定点新发/急性感染者感染早期nef进化以及与CTL应答的关系的研究,有可能为HIV疫苗靶位的选择提供重要的线索。　　 方法：　　 1、研究对象　　 本试验选取8例确认为新发/急性感染者为研究对象,其中在6个月内HIV抗体开始变阳性者2例,HIV抗体阴性但HIV RNA刚性者6例;最早观察点(确认HIV感染后第一次采集血样的时间,以下叫做观察点1)实验室分期(Filebig,E.W)Ⅳ期6例,Ⅵ期2例。这8例均为CRF01_AE亚型且未经抗病毒治疗。根据setpoint点病毒载量水平分为高病毒setpoint组(＞4 log10copies/mL)和低病毒setpoint组(＜4 log10copies/mL)[13]。所有研究对象均签署伦理-知情同意书。　　 2、CD4+T淋巴细胞测定　　 20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免沈溶血素450μl,室温避光15min,用FACS MMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。　　 3、病毒载量测定　　 以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750,000copies/ml。　　 4、病毒核酸提取、RT-PCR　　 以抗凝140μl血浆提取病毒基因组RNA,按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取RNA,提取物溶于60μl沈脱液中。RT反应体系基于SuperScript(R)Ⅲ Reverse Transcriptase Kit(invitrogen)　　 5、巢氏聚合酶链反应(nest-PCR)　　 以外侧引物对:O1(5-GTGCCTCTTCAGCTACCACCG-3HXB25853-5877nt)和O2(5-TTACTACTTGTTACTGCTCCATGT-3 HIV-1 HXB28936-8913 nt);内侧引物对:I1(5-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGG AAGAAG-3HIV-1 HXB27850-7879nt)和12(5-AGCTGGATCCGTCTTGAGATA CTGCTCCTAC-3HIV-I HXB28914-8884nt),用于扩增HIV-1 nef序列。　　 6、PCR反应产物纯化　　 取终产物5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳,经Ultra-Violet Product凝胶成像后与marker比对,确认所需片段,用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。　　 7、TA克隆　　 扩增的nef基因600bp片段插入克隆载体pMDTM18-T Simple Vector,转入化学感受态菌DH5a扩大培养,然后提取质粒DNA双脱氧终止法测序。　　 8、序列分析　　 测得的序列用Contig软件对每个样品的全长nef核苷酸序列进行拼接。用BioEdit软件进行编辑校正,用Clustal X程序将样品序列nef区进行序列排列比对。比对的序列转换成MEGA格式,下载HIV序列数据库(http://hiv-web.lanl.gov)中HIV-1亚型参考序列,用MEGA4软件的Neighbor-joining法进行系统树分析。用Distances程序计算序列间的基因离散率,用SNAP在线工具分析同义替代及非同义替代。　　 9、特征性氨基酸分析　　 用Highlighter在线分析HIV-1 nef基因核苷酸多态性、插入、缺失的位置和特征性氨基酸。用syfpeithi在线预测HLA-1限制性CTL表位。使用Simplot软什进行重组断点分析。　　 10、统计学处理　　 用SPSS17统计软件进行统计分析:用非参数检验(Mann-Whitney检验)分析不同setpoint组基因离散率;用Pearson检验分析不同setpoint组,同义替代(dS)、非同义替代(dN)以及dN/dS与调定点CD4的相关性。　　 结果：　　 1、不同setpoint组感染早期病毒nef基因多样性比较每例研究对象的观察点1克隆序列之间的基因离散率,反映了感染早期病毒的多样性。其中高setpoint组的离散率为0.0034±0.9025,低setpoint组的离散率为0.0047±0.0015,两组数据无统计学差异。提示了在感染早期,基因nef高度同源,尚未明显分化,所以多样性不明显。　　 2、不同setpoint组感染早期核苷酸趋异性分析　　 观察点2为病毒复制从高峰下降后达到的稳定时期,观察点2nef基因clone株与观察点l的clone株的离散率的差异,反映了感染早期阶段nef基因进化的程度。结果提示高病毒setpoint组(0.0097±0.0060)趋异性与低病毒setpoint组(0.0080±0.0030)的趋异性无明显差别。提示感染早期nef基因进化不明显。　　 3、不同setpoint组nef基因选择压力分析　　 在HIV-1的研究中,常用dN/dS ratios来衡量选择压力,dN/dS ratios大于1代表阳性选择压力,dN/dS ratios小于1代表阴性选择压力。结果显示,setpoint点时两组人群dS、dN,以及dN/dS ratios均无显著性差异,发现dN/dS ratios与CD4计数有正相关的趋势(R=0.653,P=0.015)。　　 4、不同setpoint组患者感染早期病毒逃逸突变差异的研究　　 除320527未发现明显突变外,其余研究对象均发生突变,不同感染者感染早期nef蛋白突变存在差异。　　 5、不同感染者体内同源病毒进化差异的研究　　 通过流行病学及全长env基因分析发现12例原发感染者中存在2对同源传播对,其中一对为高度同源株单一病毒株传播,而另外一对情况较复杂,其中一例为单一病毒株传播,另一例则感染了2株病毒,其感染先后时序不明。　　 结论：　　 1、辽宁MSM人群HIV-1 AE亚型新发/急性感染者,感染早期病毒nef高度同源,但检测出两名两株以上病毒感染者。　　 2、辽宁MSM人群HIV-1 AE亚型新发/急性感染者,感染早期nef区以净化选择为主,也有免疫选择压力存在。　　 3、辽宁MSM人群HIV-1 AE亚型新发/急性感染者,不同感染者感染早期nef蛋白突变存在差异。　　 4、辽宁MSM人群HIV-1 AE亚型新发/急性感染者中,调定点低者在感染早期nef重要功能区检出HLA-Ⅰ限制性CTL应答的证据,该区域的逃逸突变可能降低病毒复制适应性,进而与低载量有关。