研究目的:本研究首先通过临床研究,评价了化肝通络方(Huagantongluofang,HGTLF)治疗乙肝肝纤维化的临床疗效;随后制备肝纤维化动物模型,探讨化肝通络方干预肝纤维化模型的影响及可能的作用机制,并研究肝纤维化中Thl7细胞分化的潜在调控机理。研究方法:1.化肝通络方对肝纤维化患者临床疗效研究60例慢性乙型肝炎(CHB)患者,随机分为2组:化肝通络方联合ETV治疗组患者利用化肝通络方联合恩替卡韦(entecavir,ETV)治疗,对照组患者仅接受ETV治疗。观察6月,比较治疗前后中医证候积分、血清肝功能指标、血清肝纤维化指标变化情况。2.化肝通络方干预胆汁淤积性肝纤维化动物模型的评价和机制研究将72只SD大鼠随机分为5组,包括:HGTLF高剂量组、HGTLF中剂量组、HGTLF低剂量组、熊去氧胆酸(UDCA)和假手术。采用结扎胆总管方法制备肝纤维化大鼠模型,在造模成功后,药物干预4周后采集血清及肝组织。采用生化方法测定大鼠肝功能、常规病理、ELISA测定血清基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达,RT-PCR测肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、NF-κB、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)、p38、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)和金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitors of metalloproteinase-l,TIMP-1),流式分析测各组大鼠Th17细胞比例。3.探索肝纤维化模型Th17细胞分化的调控机制3.1健康雄性C57BL/6小鼠,腹腔注射10%CCL4橄榄油溶液建立肝纤维化模型,对照组给予等量橄榄油,10周后处死小鼠。测小鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine Transaminae,ALT)和天冬氨酸转氨酶(Aspartate transaminase,AST);分离小鼠肝组织中浸润的CD4+T细胞,流式检测CD4+T细胞中的Th17细胞(CD4+IL-17A+)比例;ELISA测血清IL-17A和 IL-22 含量;Real-time PCR 测 IL-17A 和 IL-22 的表达。3.2取材模型小鼠和对照组小鼠的肝脏组织,利用real-time PCR检测miR-29a、miR-652和ARRB1 mRNA的表达;Western blot检测ARRB1的蛋白表达。3.3分离正常小鼠脾脏中的CD4+ T细胞,转染pre-NC或miR-29a mimic或miR-652 mimic后,经活化培养后,再在诱导Th17细胞生成的培养基中培养。流式检测过表达miR-29a或miR-652对Th17细胞比例的影响;ELISA试剂盒检测过表达miR-29a mimic或miR-652 mimic 对 IL-17A 和 IL-22 含量的影响;real-time PCR 检测过表达 miR-29a mimic或 miR-652 mimic 对 IL-17A、IL-22 mRNA 和 ARRB1 mRNA 水平的影响;Westernblot 检测过表达miR-29a mimic或miR-652 mimic对ARRB1蛋白水平的影响。3.3分离正常小鼠脾脏中的CD4+ T细胞,转染相应载体后分组,(miR-29a mimic、miR-652 mimic 组、miR-29ainhibitor、miR-29amimic+ARRB1 mimic 共转染组,经活化培养后,再在诱导Th17细胞生成的培养基中培养。流式检测各组Th17细胞比例;ELISA、real-time PCR测各组IL-17A和IL-22含量的表达;Western blot检测ARRB1蛋白水平的影响。3.4培养HEK293T细胞,采用双荧光素酶报告基因法验证miR-29a/miR-652与ARRB1的关系。分离培养正常小鼠脾脏来源的CD4+ T细胞,转染miR-29a mimic/miR-652 mimic/miR-29a mimic+ miR-652 mimic,观察 ARRB1 的表达;CD4+ T 细胞转染 miR-29a inhibitor/miR-652 inhibitor/miR-29a inhibitor+miR-652 inhibitor,观察 ARRB1 的表达情况。3.5分离正常小鼠脾脏中的CD4+T细胞,转染相应载体后,经活化培养,再在诱导Th17细胞生成的培养基中培养3天。观察细胞共转染miR-29a mimic或miR-652 mimic和pcDNA-ARRB1对IL-17A和IL-22的含量和表达的影响。3.6健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射CCL4,8周后,分3组:对照组,Ad-miR-29a组,Ad-miR-652组(构建miR-29a或miR-652过表达的腺病毒载体),采取尾静脉注射方式给药,每周两次,共延续10周。测ALT和AST含量;流式检测Th17细胞比例;real-time PCR 和 western blot 检测 ARRB1 表达。研究结果:1.化肝通络方对肝纤维化患者临床疗效研究两组慢性乙肝(CHB)患者治疗前后比较结果显示,与对照组相比,化肝通络方联合ETV治疗组能明显改善患者临床症状:右胁疼痛、口干、口苦、腹胀、纳呆、尿黄、便秘、面色晦暗、唇紫、舌紫暗、苔黄腻等;改善部分肝功能指标:ALT、AST、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)以及谷氨酰转移酶(Gamma-glutamyltransferase,GGT)及部分肝纤维化指标:透明质酸(Hyaluronic acid,HA)、Ⅳ 型胶原(Ⅳ collagen,IVC)、胶原肽 Ⅲ(Peptide collagenⅢ,PCⅢ),差异具有统计学意义(P<0.05)。2.化肝通络方干预胆汁淤积性肝纤维化动物模型的评价和机制研究2.1与模型组比,化肝通络方药物干预各组肝功能水平均下降(P<0.05),与UDCA组相比,差异有统计学意义(P<0.05);药物干预各组肝脏组织炎性细胞浸润减少。2.2与模型组比较,化肝通络方药物组各项肝纤维化化相关因子TGF-β1、NF-κB、PDGF、p38、ICAM-1、TIMP-1 有明显下降(P<0.05);2.3与模型组比较,化肝通络方药物组TH17分化比例明显下降,高剂量组更显著。3.探索肝纤维化模型Th17细胞分化的调控机制3.1与对照组相比,模型组小鼠血清中ALT和AST明显升高(P<0.05),流式检测CD4+T细胞中的Th17细胞比例明显升高(P<0.05);ELISA、real-time PCR测血清IL-17A、IL-22显著降低(P<0.05)。3.2与对照组相比,模型组肝脏组织中miR-29a和miR-652低表达,ARRB1显著升高(P<0.05)。3.3 CD4+T细胞共转染miR-29a mimic或miR-652 mimic后,显著降低Th17细胞比例(P<0.05);ELISA、Rt-PCR检测提示IL-17A和IL-22的含量和表达显著降低(P<0.05);Rt-PCR和 Western blot 检测显示抑制 ARRB1 mRNA 水平(P<0.05)。3.4培养HEK293T细胞,双荧光素酶报告基因法验证,和对照组相比,miR-29a mimic/miR-652 mimic 抑制 ARRB1 荧光素酶活性,而 miR-29a inhibitor/miR-652 inhibitor促进 ARRB1 荧光素酶活性;CD4+ T 细胞转染 miR-29a inhibitor 或 miR-652 inhibitor 或miR-29a inhibitor+ miR-652 inhibitor,与对照组相比,Rt-PCR 和 Western blot 检测显示ARRB1 mRNA水平明显增加(P<0.05)。3.5过表达miR-29a或miR-652显著降低IL-17A、IL-22的含量,同时过表达ARRB1逆转了 miR-29a 或 miR-652 过表达对 1L-17A、IL-22 的影响(P<0.05)。3.6肝纤维化模型注射miR-29a或miR-652过表达的腺病毒载体,与对照组相比,ALT和 AST 含量、Th17 细胞比例显著抑制(P<0.05);real-time PCR 和 western blot 检测 ARRB1表达显著降低(P<0.05)。研究结论:1.化肝通络方对肝纤维化患者临床疗效研究化肝通络方联合ETV与单用ETV治疗乙肝肝纤维化湿热瘀毒证患者,两组均能明显改善患者临床证候,降低患者肝功能指标、肝纤维化水平。其中化肝通络方联合ETV治疗组在改善患者证候,部分肝功能指标(ALT、AST、ALP、GGT)及部分肝纤维化指标(HA、IVC),较单用ETV组有优势。2.化肝通络方干预胆汁淤积性肝纤维化动物模型的评价和机制研究化肝通络方能剂量依赖地降低肝脏损伤,改善肝纤维化。其抗肝纤维化机制可能是通过抗炎和抑制肝星状细胞活化而减少肝细胞损伤,其中TGF-β1、NF-κB、PDGF、p38参与其逆转肝纤维化过程。同时,TH17细胞分化在化肝通络方治疗肝纤维化中起到了重要作用。3.探索肝纤维化动物模型Th17细胞分化的调控机制CCL4诱导的肝纤维化显着增加了 Th17细胞的百分比,IL-17A、IL-22的水平以及ALT和AST的表达;此外,miR-29a/miR-652过表达显着降低ALT、AST指标、Th17分化以及ARRB1的表达,表明过表达miR-29a/miR-652对肝纤维化的保护作用。因此,miR-29a和miR-652通过阻遏ARRB1介导的Th17细胞分化改善肝纤维化进展。