随着人们健康意识的提高,低聚果糖受到广泛的关注。它是一种强效益生元,具有促进肠道菌群平衡,提高人体免疫力等多种生理功效,在食品领域中有重要的工业价值。内切菊粉酶可以水解菊粉内部的β-2,1糖苷键获得低聚果糖。与传统的利用果糖基转移酶的生产方法相比,该法操作简单、副产物含量低、生产效率高。但目前内切菊粉酶的来源十分有限,且存在产量低、酶学性质不佳等问题,难以满足工业生产的需要。因此寻找多样的微生物来源,从中获得能够高效、专一催化菊粉产生低聚果糖的新型内切菊粉酶十分必要。本研究通过理性基因挖掘发现首个酵母来源的内切菊粉酶基因,成功将其在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现可溶性表达;将该酶分离纯化后,探究其酶学性质和水解产物;同时,通过发酵优化提高其产量,通过分子对接建模和定点突变提高其催化活力。论文主要研究成果如下:1.内切菊粉酶的基因挖掘和异源表达。通过理性基因挖掘获得三段不同微生物来源的潜在内切菊粉酶,通过酶活验证得到Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557唯一可能具有内切菊粉酶活性,但产酶水平不高。对该酵母来源的潜在内切菊粉酶基因序列inu3进行深入比对、转录分析、酶活检测和SDS-PAGE分析,确定了编码内切菊粉酶的关键基因inu3B,并通过载体pET-22b（+）在E.coli BL21（DE3）中实现了可溶性表达。2.内切菊粉酶的酶学性质研究。以菊粉为底物,INU3B酶活为2262.8 U·mg^-1,是迄今报道的最高值。INU3B的最适温度为70℃,最适pH为5.0-6.0,具有较强的热稳定性和pH耐受性。其底物亲和力和催化速率都较高,K_m和V_max值分别为10.6 mg·m L^-1和2564.1μmol·mg^-1·min^-1。催化水解菊粉时,产物主要为DP3、DP4和DP5,无葡萄糖、果糖等副产物生成。3.摇瓶水平的发酵优化。优化后的最佳发酵条件为:将重组E.coli接种到含有葡萄糖8 g·L^-1,酵母提取物24 g·L^-1,蛋白胨12 g·L^-1,磷酸盐200 mM的发酵培养基中,37℃、180 r·min^-1培养2 h后,加入0.1 m M IPTG,然后转入20℃,诱导36 h。优化后酶活达到1316.3 U·m L^-1,是未优化前的2.13倍。4.半理性改造提高内切菊粉酶的催化活力。通过同源建模构建INU3B的三维蛋白结构模型,并与蔗果四糖GF4进行分子对接。对组成底物结合口袋的7个关键氨基酸(M⁴⁶、F¹⁰⁴、T¹⁰⁵、V²³⁹、T²⁶⁰、S³²⁶、Y³²⁷)进行丙氨酸突变,筛选获得了唯一的正向突变体M46A,比酶活达到2611.40 U·mg^-1,是原始酶INU3B的1.26倍。此外,其余6株突变体的酶活均呈现不同程度的下降,推测结合口袋处的氨基酸对内切菊粉酶催化活性具有重大影响。