第1章引言动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是由多种损伤因素引起内皮细胞活化,分泌多种炎症介质,进而诱导单核/巨噬细胞、白细胞等炎症细胞参与的慢性炎症疾病。因此,内皮细胞活化是启动AS发生的关键环节。脂质代谢紊乱是AS发生发展的独立危险因素,越来越多的证据表明,卵磷脂的水解或氧化型低密度脂蛋白（oxidize low density protein,ox-LDL）进一步氧化修饰过程产生一类具有生物活性的溶血磷脂（lysophospholipids,LPLs）,诱导内皮细胞活化（Endothelial cell activation）,进而释放炎症分子、粘附分子及趋化因子等,诱导血液中单核细胞向血管内皮趋化、粘附,启动AS过程。因此,深入阐明AS早期内皮细胞活化机制,特别是这类具有生物活性的溶血磷脂诱导的内皮细胞活化机制,将为临床预防AS相关疾病提供理论依据和新的干预靶点。第2章ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化早期主动脉中LPI显著升高目的:研究AS早期主动脉中脂质组学水平及其与AS发生的相关性。方法:WT（Wild Type,WT）小鼠和ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠,给予高脂饲喂3周后（AS早期模型）,分别提取WT和ApoE-/-小鼠的主动脉,高效液相色谱联合质谱分析脂质组学水平。并进一步检测WT小鼠及ApoE-/-小鼠高脂饲喂3周、6周和12周后,血清中溶血磷脂酰肌醇（lysophosphatidylinositol,LPIs）,胆固醇（cholesterial）及甘油三酯（Triglyceride）水平,以及LPI合成磷脂酶PLA（Phosphorlipase A,PLA）和降解磷脂酶PLC（Phosphorlipase C,PLC）表达水平。结果:高脂饲喂3周后,ApoE-/-小鼠主动脉中3种类型的LPIs（palmitoyl-LPI、stearoyl-LPI和oleoylgl-LPI）表达水平均显著高于WT小鼠。此外,随着高脂饲喂时间的延长,3种LPI、胆固醇和甘油三酯水平逐渐升高。再者,LPI代谢相关磷脂酶水平检测结果显示:相比WT小鼠,ApoE-/-小鼠血清中LPI合成磷脂酶PLA显著升高,而LPI降解磷脂酶PLC表达水平显著降低。最后我们进一步将3种LPI水平与胆固醇（Cholesterial）和甘油三酯（Triglyceride）水平作相关性分析,发现palmitoyl-LPI水平与胆固醇和甘油三酯水平显著正相关。（后续实验中均用此种LPI干预细胞,即下文中LPI是指palmitoyl-LPI）。结论:在AS早期,具有生物活性的脂质——LPI显著升高,可能启动AS过程。进一步对LPI合成酶与降解酶表达水平分析表明,AS早期LPI水平升高可能是由于高脂血症上调LPI合成磷脂酶的表达水平,而抑制LPI降解磷脂酶水平,导致LPI蓄积增加。另外,LPI水平随着高脂饲喂时间的延长而逐渐升高,表明LPI伴随着整个AS过程。最后,LPI与高脂血症作相关性分析表明,LPI水平与高胆固醇血症和高甘油三脂血症显著正相关。因此,LPI在AS过程中还具有促进作用。总之,LPI很有可能启动AS发生,而且在后续整个AS过程中还发挥促进作用。第3章LPI结合特异性受体GPR55诱导内皮细胞活化、促进动脉粥样硬化形成目的:探讨LPI是否需要结合受体GPR55促进内细胞活化,进而启动AS过程。方法:为了证实AS早期升高的LPI具有促进内皮细胞活化的作用。我们用LPI干预原代人主动脉内皮细胞（Primary human aortic endothelial cells,HAECs）后,趋化因子抗体芯片（Chemokine antibody array）及免疫印迹（Western blot,WB）分析内皮细胞趋化因子及粘附分子（内皮细胞活化标志物）的表达水平。随后,我们进一步用GPR55（G-protein couple receptor 55,GPR55）小干扰RNA（small interference RNA,si RMA）阻断GPR55表达水平,分析LPI是否需要与受体GPR55结合进而促进内皮细胞活化。除了体外HAECs实验,我们还进一步构建GPR55-/-小鼠,然后与Apo E-/-小鼠进行基因杂交,获取双基因敲除小鼠（即Apo E-/-/GPR55-/-小鼠）,从整体动物实验水平,证实LPI结合GPR55激活内皮细胞启动AS过程。为此,我们采用Introvital microscope技术分别观察Apo E-/-/GPR55-/-和Apo E-/-小鼠提睾肌小静脉中滚动（Rolling cells）和附壁（Adhesion cells）炎症淋巴细胞的数量,以及主动脉苏丹Ⅳ染色（En face实验）检测小鼠主动脉中斑块面积,以期从整体动物实验证实LPI结合GPR55激活内皮细胞启动并促进AS形成。结果:LPI（10μM）干预HAECs 18 h后,HAECs中大量促炎、促活化的趋化因子（CXCL16、TIG2、CXCL5、CCL26、CX3CL1、CXCL1、CCL1、IL8、IL16、CXCL10、CXCL11、SCM-1a、MCP-1、MDC、Midkine、CXCL9、MIP1a/b、CCL15、CCL20、CCL19、CCL18、CXCL4、CCL5、CXCL12、CCL17和CXCL17）表达显著升高;其次,Western Blot结果显示,LPI显著上调三种重要的粘附蛋白——ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达水平。然而,一旦预先用GPR55-si RNA干预HAECs抑制GPR55表达后,能显著抑制LPI诱导的ICAM-1表达。另外,我们在体实验结果表明,相比对照组小鼠（即Apo E-/-小鼠）,GPR55敲除小鼠（即Apo E-/-/GPR55-/-小鼠）提睾肌小静脉中Rolling cells和Adhesion cells数量均显著降低。再者,主动脉斑块面积分析也表明:相比对照组Apo E-/-小鼠,敲除GPR55后（即Apo E-/-/GPR55-/-小鼠）能显著降低主动脉斑块面积。结论:我们体内/外实验结果均表明:LPI结合内皮细胞膜上的GPR55受体,诱导内皮细胞活化进而分泌促炎、促活化细胞因子及粘附蛋白。这些细胞因子进一步诱导、促进单核细胞、淋巴细胞聚集,并向血管内皮附壁滚动、粘附,加速动脉粥样硬化形成。总之,LPI-GPR55在激活内皮细胞启动AS过程中发挥重要作用。第4章LPI-GPR55介导ADMA生成目的:探讨LPI-GPR55调控的下游信号分子。方法:为寻找GPR55调控的下游信号分子/物质,我们采用基于60种肿瘤细胞株所建立的基因数据库（micro-Array database）和代谢物数据库（Metabolic database）,将GPR55表达水平与代谢物水平作相关性分析,并筛选出与GPR55表达水平最为显著相关的一种代谢物（Asymmetric dimethyl l-arginine,ADMA）,即该代谢物（ADMA）可能为GPR55的下游调控物质。为进一步证实GPR55与ADMA的正相关性也存在于我们研究的AS模型中,我们也分别检测了Apo E-/-和WT小鼠主动脉中GPR55和ADMA水平。随后,我们进一步探讨LPI-GPR55调控下游ADMA水平的可能机制。我们采用RT-PCR和Western Blot检测ADMA合成酶——蛋白精氨酸甲基转移酶（Protein arginine methyltransferase 1,PRMT-1）和降解酶——二甲基精氨酸二甲胺水解酶（Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase,DDAH-2）的m RNA和蛋白质表达水平。液相色谱质谱连用检测HAEC和主动脉中ADMA表达水平。结果:首先,我们发现在细胞株中GPR55的表达水平和非对称性二甲基精氨酸（Asymmetric dimethyl l-arginine,ADMA）水平呈显著正相关。同时,在体AS模型中GPR55和ADMA表达水平显示:相比WT小鼠,Apo E-/-小鼠主动脉中GPR55和ADMA表达水平均显著升高,即AS模型中GPR55与ADMA也存在正相关性。然后,我们进一步设计体内/外实验检测LPI-GPR55对ADMA及ADMA相关代谢酶的影响。结果显示:用LPI干预HAECs后,ADMA合成酶PRM-1的m RNA和蛋白水平均呈浓度依赖性升高,相反,其降解酶DDAH-2的m RNA和蛋白水平均呈浓度依赖性降低。同时LPI干预后,HAECs中ADMA水平呈浓度依赖性升高。此外,相比Apo E-/-小鼠,GPR55敲除后（Apo E-/-/GPR55-/-）小鼠主动脉中ADMA合成酶PRM-1的m RNA和蛋白水平均降低,相反,其降解酶DDAH-2的m RNA和蛋白水平均升高,主动脉中ADMA水平也显著降低。结论:在细胞株中,GPR55与ADMA有显著正相关。而这种正相关性也同样存在于我们的AS模型中。这些结果表明,ADMA是LPI-GPR55调控的下游物质。随后我们探讨了LPI-GPR55调控ADMA水平的可能机制,结果显示,在HAECs和小鼠主动脉中,LPI-GPR55通过上调ADMA合成酶PRMT-1表达,抑制其降解酶DDAH-2表达,进而导致ADMA蓄积增加。总之,LPI通过调控内皮细胞中PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路,介导ADMA合成。第5章LPI-GPR55促进ADMA诱导的mt ROS生成目的:探讨LPI-GPR55促进ADMA生成是否能诱导线粒体活性氧生成增加。方法:LPI处理HAECs后,利用检测线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species,mt ROS）水平的特异性荧光探针mito-SOX,结合流式细胞术和共聚焦显微镜（Confocal microscope）检测mt ROS水平,并进一步用特异性较强的电子自旋共振技术（electron spin resonance,ESR）检测线粒体自由基（即mt ROS）水平。为了探讨mt ROS介导转录因子AP-1（Active protein 1,AP-1）对ICAM-1（intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）表达水平的调控作用,我们采用电泳迁移率（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测AP-1与ICAM-1启动子结合能力。结果:LPI干预HAECs后,首先,我们利用mt ROS的特异性荧光探针mito-SOX结合流式细胞术检测mt ROS水平,结果显示,LPI处理后mito-SOX水平呈浓度依赖性升高;其次,我们还借助共聚焦显微镜同样观察到,LPI干预后,HAECs线粒体中荧光强度呈浓度依赖性升高。最后,ESR也得到同样的结果,LPI-GPR55促进mito-TEMPO-H水平呈浓度依赖性升高。然而,PRMT-1si RNA预处理HAECs,抑制ADMA表达,流式结果显示mt ROS生成也相应减少。随后,我们进一步探讨生成的mt ROS对AP-1与ICAM-1启动子结合能力的影响。EMSA结果显示:LPI干预HAECs后,促进转录因子AP-1与ICAM-1启动子结合,而一旦用mt ROS特异性抑制剂mito-TEMPO抑制mt ROS生成后,显著减弱AP-1与ICAM-1启动子结合能力。结论:我们通过流式细胞术、ESR及共聚焦显微镜三种方法证实LPI-GPR55介导mt ROS合成增加。而mt ROS的增加,一方面,促进AP-1与ICAM-1启动子结合,上调ICAM-1表达水平,促进内皮细胞活化;另一方面,mt ROS合成增加也加速内皮细胞氧化损伤,加速AS形成。第6章总结本研究表明,AS早期高脂血症促进LPI合成酶PLA升高而抑制降解酶PLC表达,导致LPI蓄积增加。高水平LPI结合其特异性受体GPR55诱导内皮细胞活化,分泌趋化因子和粘附分子,后者诱导单核细胞-内皮细胞粘附。进一步在体实验证实,LPI-GPR55促进血液中白细胞/淋巴细胞向血管内皮附壁、滚动粘附,最终导致AS形成。然后,我们进一步进行潜在机制探索。我们发现LPI-GPR55介导内皮细胞内ADMA合成增加,后者进一步促进mt ROS生成。生成的mt ROS一方面促进AP-1与ICAM-1结合上调ICAM-1表达,诱导内皮细胞活化启动AS;另一方面,mt ROS合成增加导致内皮细胞氧化损伤加重AS。总之,通过人原代内皮细胞（Human aortic endothelial cells,HAECs）及整体动物实验研究,我们发现AS早期升高的LPI结合受体GPR55,通过PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路,介导mt ROS合成增加,促进AP-1核转位上调粘附分子ICAM-1表达水平,诱导内皮细胞活化,进而启动和促进AS过程。通过本实验研究,我们进一步阐明了LPI诱导内皮细胞活化启动AS的可能机制,这将为临床预防和治疗AS提供理论依据和新的治疗靶点。