背景与目的:尽管急性白血病的治疗效果近年来有了较明显的提高,但仍然有15～30%的病人发生原发性耐药,60～80%的患者完全缓解后因继发性耐药复发而死亡。随着生物学技术快速发展,人们发现真核细胞内蛋白质降解大部分是通过泛素—蛋白酶体通路（Ubiquitin-Protease Pathway,UPP）完成,人白血病细胞含有异常高水平的蛋白酶体活性,且在诱导终末白血病细胞分化时蛋白酶体迅速被下调,表明蛋白酶体的活性与白血病细胞的恶性增殖有着密切相关性,因此蛋白酶体可能成为白血病治疗的新靶点。目前研究证实,蛋白酶体在细胞内蛋白降解、MHC-I类抗原递呈、细胞内部错误折叠蛋白的修复上发挥着重要的功能,多种与细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡相关的蛋白的正常代谢,都与其功能的正确执行密切相关。特异性阻断蛋白酶体功能显著改变以上蛋白在细胞内的表达水平,导致细胞内蛋白质代谢发生紊乱,从而诱导细胞发生凋亡,是目前认识的蛋白酶体抑制剂主要的抗肿瘤作用机制。硼替佐米（Bortezomib）是第一个被美国FDA批准用于临床的蛋白酶体抑制剂,唯一的适应症是难治、复发性多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）的治疗。此外,初步的多项临床试验表明硼替佐米单独或联合其他药物治疗非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、肺癌、卵巢癌等也具有良好效果。有关硼替佐米治疗急性髓系白血病的研究至今很少报道,我们前期工作中发现硼替佐米体外能够抑制急性髓系白血病细胞株HL60的增殖并诱导其凋亡,与三尖杉酯碱（HT）或三氧化二砷（As₂O₃）联合后作用明显增强,但它们对产生多药耐药的急性髓系白血病细胞的作用如何至今尚缺乏报道,此乃是本研究立题的主要动机。研究方法:首先选择急性髓系白血病多药耐药细胞株HL60/ADM为研究对象。应用MTT法比较HL60/ADM和HL60细胞之间对阿霉素杀伤作用的敏感性。以耐药倍数大于30倍定义为耐药,此后将HL60/ADM细胞培养于含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基中进行培养。经过预实验在0～1000nM之间筛选硼替佐米对HL60/ADM细胞作用的最佳浓度,在0～72h之间选择处理的最佳时间,在0～752nM之间确定HT的IC₅₀浓度,在0～40μM之间确定As₂O₃的IC₅₀浓度,依据台盼蓝拒染法确定各实验组处理后细胞存活情况。确定硼替佐米0～50nM为后续实验浓度,作用48h为最佳处理时间。硼替佐米的IC₅₀浓度约为20nM,HT的IC₅₀浓度为752nM,As₂O₃的IC₅₀浓度为15μM。在上述预实验的基础上,将HL60/ADM细胞分为硼替佐米、As₂O₃或HT单药处理组、硼替佐米联合As₂O₃处理组和硼替佐米联合HT处理组,每组处理的细胞数一致,每组均设置空白对照组。各组检测指标相同,即用MTT法检测细胞增殖、应用AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞术和Hoechst33342染色检测细胞凋亡,并应用流式细胞仪检测HL60/ADM细胞摄取阿霉素的情况。在完成上述实验研究之后,选择9例复发、难治性急性髓系白血病患者原代细胞应用MTT法研究其增殖变化。硼替佐米不同浓度间增殖活性差异采用单因素方差分析;硼替佐米联合HT或As₂O₃对HL60/ADM白血病细胞增殖活性影响比较使用析因分析;细胞凋亡改变采用方差分析,两两比较采用LSD法;阿霉素阳性率比较采用两样本t检验。药物联合后对原代细胞的细胞活性差异采用随机区组方差分析,两两比较采用LSD法检验。结果:1.HL60/ADM细胞的耐药性确定通过MTT法检测HL60/ADM或白血病细胞对阿霉素的敏感性发现,阿霉素作用于HL60/ADM细胞的IC₅₀值约为16.283μg/ml,作用于HL60细胞的IC₅₀值仅为0.087μg/ml,HL60/ADM细胞对阿霉素高度耐药,耐药倍数为187倍。2.硼替佐米对HL60/ADM白血病细胞增殖、凋亡的影响台盼蓝拒染计数显示:0、10、20、30、40、50nM硼替佐米处理HL60/ADM白血病细胞12小时,各浓度间活细胞数无统计学差异（P＞0.05）,延长时间至24h,各浓度硼替佐米对细胞的抑制效应差异开始显现。随着时间的延长和浓度增加,处理组细胞增殖抑制率逐渐增加。MTT法检测结果显示:10～50nM硼替佐米处理12～60h对HL60/ADM白血病细胞均具有增殖抑制作用,随处理时间延长和药物剂量增加,细胞增殖抑制率逐渐提高,呈明显时间—剂量依赖关系。其48h IC₅₀值约为20nM,其中40nM处理48h达最大抑制效果（抑制率61%）,继续增加剂量或者延长作用时间至60h,抑制效果无明显增强（P=0.478,P=0.161）。Hoechst33342染色形态学观察显示:未加硼替佐米的空白对照组细胞,核呈弥漫均匀蓝色荧光,而10nM、20nM和50nM硼替佐米处理组细胞均出现核固缩、凝集,并有凋亡小体,表现为明亮的颗粒状蓝染,随着浓度增加凋亡小体逐渐增多。AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测凋亡发现:10nM硼替佐米处理HL60/ADM细胞24h,其平均细胞凋亡率为9.58%,对照组为8.85%（P＜0.05）;同样处理时间下,20nM硼替佐米处理组平均细胞凋亡率为16.45%,显著高于10nM处理组（P均＜0.01）;延长作用时间至48小时,10nM硼替佐米处理组细胞凋亡率增加至17.22%,20nM处理组细胞凋亡率则明显增高达73.46%,均显著高于对照组（14.84%,P＜0.05）,与同剂量下作用24h相比,差异具有显著统计学意义（P均＜0.01）。3.硼替佐米联合三尖杉酯碱或三氧化二砷对HL60/ADM白血病细胞增殖、凋亡的影响MTT法检测结果显示:HT或As₂O₃单独应用对HL60/ADM白血病细胞均具有剂量依赖性增殖抑制作用,其中94、188、376、564、752nM HT和2、4、10、20、30、40μM As₂O₃处理HL60/ADM白血病细胞48h,细胞增殖抑制率分别为9%、20%、31%、39%、52%和25%、33%、40%、58%、64%、69%;HT及As₂O₃对HL60/ADM白血病细胞48h的IC₅₀浓度分别为752nM和15μM。10～50nM的硼替佐米对HL60/ADM白血病细胞增殖同样表现出抑制作用,其48h的IC₅₀浓度约为20nM。将752nM HT或15μM As₂O₃分别与10～50nM的硼替佐米联合,可观察到联合处理后细胞抑制效果进一步增强;在达到药物最大抑制效果前,硼替佐米联合组对细胞增殖的抑制效果显著高于硼替佐米单药组（P均＜0.05）;析因分析显示:10nM硼替佐米与752nM HT联合处理的效果显著比硼替佐米单药处理组高,但与相同剂量HT单独处理组相比,其差异无统计学意义,P＞0.05;而10nM硼替佐米与15μM As₂O₃联合处理组的抑制率均显著高于二者相同剂量单药处理组,P＜0.05;Hoechst33342染色结果显示:经48h培养空白对照组细胞未见明显凋亡发生,细胞核呈弥漫均匀蓝色荧光;10nM硼替佐米单药处理组细胞可见核固缩、凝集,并伴凋亡小体,其表现为明亮的颗粒状蓝染。硼替佐米与As₂O₃或HT联合处理组凋亡小体数量均多于各单药处理组,以硼替佐米与As₂O₃联合组更明显。流式细胞仪检测结果显示:各实验组细胞经药物处理后细胞变化以凋亡为主。As₂O₃与硼替佐米联合处理组24、48h后的细胞凋亡率均显著高于硼替佐米单药组:其中处理48h二者平均细胞凋亡率分别为81.89%和17.22%（P＜0.01）;同样,HT联合硼替佐米处理组24、48h凋亡率亦高于硼替佐米单药处理组;在48h二者平均细胞凋亡率分别为80.64%和17.22%（P＜0.01）。检测细胞阿霉素阳性率显示:在相同浓度阿霉素培养体系中,加入硼替佐米处理组细胞的荧光阳性率显著高于对照组（P均＜0.05）,提示硼替佐米可能促使HL60/ADM白血病细胞摄取阿霉素或使其在细胞内排除延迟。4.硼替佐米联合三尖杉酯碱或三氧化二砷对复发、难治性急性髓系白血病原代细胞增殖影响10～200nM硼替佐米均能抑制原代白血病细胞增殖,抑制率随浓度增加而逐渐增高,其中10nM、20nM、40nM、80nM、100nM和200nM剂量处理48h,平均抑制率分别为8.7%、18.1%、26.8%、39.2%、48.06%、51.44%;与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;10～100nM剂量组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）;100nM～200nM剂量组抑制率无显著性差异（P=0.290）。20nM硼替佐米联合752nM HT处理48h,原代细胞平均增殖抑制率与两药单独作用时比较无明显差异（P均＞0.05）:而与15μM As₂O₃联合处理48h,对原代白血病细胞平均增殖抑制率均显著高于两药单独作用时（P均＜0.05）;相同条件下处理HL60/ADM多药耐药细胞发现,联合处理组细胞增殖抑制率均高于各单药处理组（P均＜0.05）。结论:1、硼替佐米单药对HL60/ADM多药耐药细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用,其效果呈时间-剂量依赖性,随着时间的延长和剂量的增加作用显著增强。2、三尖杉酯碱和三氧化二砷对HL60/ADM多药耐药细胞均具有抑制增殖作用,效果呈剂量依赖性,各自的IC₅₀剂量下分别与不同浓度硼替佐米联合处理后,与硼替佐米单药处理组相比,其抑制增殖和诱导凋亡作用明显增强。3、硼替佐米能够促进HL60/ADM细胞对阿霉素的摄取,提高细胞内阿霉素浓度,从而降低细胞对化疗药物的耐药性,逆转耐药。4、硼替佐米、三尖杉酯碱、三氧化二砷单药均能在体外抑制急性髓系白血病原代细胞的增殖,但其抑制率明显低于HL60/ADM细胞。5、硼替佐米与三尖杉酯碱或三氧化二砷联合作用均能抑制急性髓系白血病原代细胞的增殖,与各单药作用相比,与HT联合其作用无明显提高,而与三氧化二砷联合效果均比二者单药处理时显著增强。