肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,K.p.）是最受关注的与抗生素耐药有关的病原体之一。多重耐药（multidrug-resistant,MDR）K.p.和泛耐药(extremely drug resistant（XDR）肠杆菌科细菌引起的感染急剧上升,由这些菌株引起的感染通常高死亡率、住院时间延长和费用增加。最近的研究表明,一些K.p.同时拥有毒力和多药耐药基因,并且可以垂直和水平传播,可在健康个体中引起高毒力且耐药的肺炎克雷伯菌克隆的出现。目前,我们对高毒力且耐药K.p.的独立及耐药传播路径及机体致病机制仍然不明了,从而使我们有必要更好地了解其感染微生物学,为开发针对K.p.感染制订新策略奠定基础。胃肠道的管腔内含有大量的微生物,小肠腔估计有10³至10⁹个细胞/m L,而大肠含有的细菌,其浓度可达10¹¹至10¹²个细胞/g。作为一个整体,它构成了机体的一个动态平衡的生态系统。肠道微生物可以分解食物、促进肠腔营养的吸收和肠道发育的增强,从而提高饮食结构的多样化和人类的进化。除了消化和代谢外,肠道微生群还有助于肠上皮屏障的发育和维持、免疫系统的发育以及与致病微生物的竞争,从而阻止它们的繁殖。随着肠道菌群与肺部疾病研究越来越多,证实了肠肺轴的存在,肠道菌群影响肺部免疫反应的机制也正在一步步被揭示。肠道菌群与K.p.肺炎之间的关系,研究甚少,认识有限,本研究基于肠道菌群,探讨其如何调节K.p.肺炎肺部免疫,介导病原菌的清除。最近研究表明,在宿主与微生物群通信网络中,SCFAs发挥重要功能。SCFAs是肠道细菌发酵膳食纤维的最终产物,是上皮细胞、肝细胞和外周组织的能量来源。随着研究的深入,发现SCFAs还可以直接参与免疫系统和免疫细胞的调节。同时也是联系肠道微生物群和宿主生物体之间纽带,是维持体内平衡的重要组成部分。先前的研究描述了SCFAs对小鼠呼吸道感染发挥保护作用,揭示了SCFAs对中性粒细胞和巨噬细胞免疫调节作用的主要机制是通过结合和激活GPCR。本研究基于前人研究基础上,着重高通量方法,结合现代分子生物学核心技术-基因编辑技术,肠道内容物代谢组学联合16S r RNA和肺组织肺泡巨噬细胞转录组分析,从肠道菌群到菌群代谢产物再到组织细胞,从体内到体外进一步研究肠道菌群在K.p.肺炎中作用的机制。为今后操纵肠道微生物群改变或者精准补充细菌代谢产物控制临床抗菌药物无效的细菌性肺炎等疾病提供新的研究策略和理论支持。目的:本研究以K.p.标准菌株（ACTT 43816）感染小鼠引起急性细菌肺炎为研究对象,通过抗菌药物耗竭肠道菌群后,16S r RNA和肠道内容物代谢组学及肺泡巨噬细胞转录组分析研究肠道菌群在K.p.肺炎中的角色,及其发挥作用的作用途径和机制。结合基因编辑技术从细胞水平探讨了肠道菌群代谢产物如何调控肺部固有免疫,进一步详细阐明肠道菌群代谢产物调控肺泡巨噬细胞杀菌的分子机制,为寻找临床上抗菌药物耐药病原菌感染诊疗新方法奠定理论基础。方法:（1）予以混合抗菌药物引用水小鼠自由饮用,耗竭小鼠肠道菌群后,鼻滴法构建K.p.肺炎模型:平板菌落计数法计算两组肺组织及血液K.p.细菌菌落形成单位（CFU）;进一步肺组织病理学分析两组肺部病理改变;酶联免疫吸附试验检测肺组织细胞因子改变;Mantel-Cox检验比较两组小鼠生存差异,明确肠道菌群在K.p.肺炎中的作用;肠道菌群耗竭小鼠补充正常小鼠肠道菌群后,Mantel-Cox检验比较小鼠生存差异及肺组织病理学分析肺部病理改变,进一步明确肠道菌群在K.p.肺炎中的保护作用;（2）获取临床上细菌性肺炎患者新鲜粪便,移植给肠道菌群耗竭小鼠,肺组织免疫组化分析小鼠肺部免疫细胞改变;（3）分离肠道菌群耗竭小鼠肺泡巨噬细胞,体外研究不同背景来源肺泡巨噬细胞吞噬与清除K.p.能力;（4）16S r RNA、肠道内容物代谢组学分析肠道菌群耗竭后肠道菌群现状及代谢通路的变化,进一步关联分析,代谢产物通路变化投射至相应的菌群;（5）筛选差异代谢产物SCFAs,小鼠体内补充SCFAs后,建立小鼠肺炎模型,观察补充SCFAs对小鼠K.p.肺炎的影响:通过MHA平板计数肺组织及血液K.p.菌落计数;小鼠肺组织H&E染色,观察肺组织炎症病理变化;Mantel-Cox检验比较两组小鼠生存差异,明确SCFAs对K.p.肺炎的保护作用;分离SCFAs组及对照组小鼠肺泡巨噬细胞,体外研究清除K.p.能力;（6）肺泡巨噬细胞RNA-seq结合生物信息学分析技术,筛选出肠道菌群耗竭小鼠及正常背景下与抗菌相关的差异基因表达,并进一步RT-q PCR验证RNA-seq结果准确性,结合sh RNA干扰技术,进一步筛选两组差异的抗菌相关基因在K.p.肺炎中的调控网络和机体抵抗病原菌的作用;（7）利用CRISPR/Cas9技术是在DNA水平上对RAW264.7细胞株进行lamtor2和gpr43基因敲除,并利用RT-q PCR明确SCFAs调控lamtor2基因表达模式,Western blot鉴定SCFAs调控LAMTOR2蛋白及其下游网络信号,明确肠道菌群及其代谢产物如何精准调控细菌性肺炎肺部巨噬细胞的杀菌机制。结果:（1）通过小鼠鼻滴法可建立稳定的急性细菌性肺炎动物模型,肠道菌群耗竭小鼠在感染肺炎克雷伯菌12h和24h后肺组织及血液含菌量明显比肠道菌群正常小鼠多;肠道菌群耗竭小鼠在感染K.p.12h后肺组织表现出更广泛的炎症细胞浸润、肺血管内皮损伤出血、肺组织充血、肺泡间隔增厚/破坏及透明膜的形成,肝脏、肾脏组织同时也表现出病理损伤加重,同时存活时间缩短。ELISA结果显示,MD小鼠感染K.p.24 h后,肺组织中促炎因子TNF-α、1L-1β和IL-6及趋化因子CXCL1和MCP-1水平明显降低。感染K.p.小鼠移植正常小鼠的肠道菌群后,其生存情况明显改善,生存时间和对照小鼠无差异,均高于肠道菌群耗竭小鼠,并且肺部病理改变比肠道菌群耗竭小鼠要轻;（2）临床上细菌性肺炎患者新鲜粪便移植给肠道菌群耗竭小鼠,让小鼠肠道重新定植患者肠道微生物,免疫组化展示了定植了临床细菌性肺炎患者的肠道微生物的小鼠的肺组织中有更多的巨噬细胞浸润和正常肺组织的炎症性病理改变;（3）来自抗生素耗竭小鼠的肺泡巨噬细胞吞噬K.p.的能力与对照组肺泡巨噬细胞相比下降了一半。动态观察了1h、6h和12h时对胞内K.p.的清楚情况,发现在6h时,肠道菌群耗竭的肺泡巨噬细胞就表现出细菌负荷量增多;（4）肠道菌群耗竭小鼠与正常背景小鼠盲肠内容物进行非靶向代谢组学分析,共鉴定出1126种显著差异的代谢物,KEGG富集差异代谢产物发现主要与碳水化合物和氨基酸代谢有关。其中,SCFAs（乙酸、丙酸和丁酸）代谢通路也发生变化;（5）对细菌16S r RNA可变区V4进行测序分析,共获得了736749个高质量的16S r RNA基因序列,这些序列在97%的相似度水平上聚集成不同的操作分类单元。物种多样性分析显示,在肠道菌群耗竭的小鼠与对照小鼠相比,物种的丰富度和多样性显著降低。在门水平上,肠道菌群耗竭小鼠中的拟杆菌门和韦荣菌门明显减少,但蛋白菌门增多;在属的水平上,我们发现菌群群落的组成结构发生巨大变化,产生SCFAs的Parabacteroides,Bifidobacterium,Clostridium,Coprococcus和Prevotella属,在肠道耗竭的小鼠体内均明显减少。（6）Spearman相关分析展现出SCFAs代谢通路的改变与产短链脂肪酸肠道菌群的改变的有关系;（7）补充SCFAs后,肺炎克雷伯菌引起的脓毒症的小鼠的死亡率明显减少,生存时间增加;与对照组小鼠比较,SCFAs组小鼠肺组织及血液细菌负荷也明显减少;同时也观察到肺组织的病理改变和评分也明显减轻;在体外实验结果展示SCFAs组小鼠的肺泡巨噬细胞比对照组吞噬K.p.明显增多,同时也伴随着K.p.清除的增多,发现1h时由于SCFAs组在起始吞噬的多的原因,表现出稍高的细菌负荷,但是6h和12h在这两个时间点明显表现出SCFAs组肺泡巨噬细胞的清除能力比对照组强;（8）肺泡巨噬细胞转录组结果分析显示肠道菌群耗竭组与对照组相比在转录水平展示出巨大差异,差异基因注释显示大量参与抗菌的基因发生改变,差异基因KEGG信号通路富集显示一些参与病原微生物入侵的信号通路,如对细菌的防御反应和MAPK/ROS信号及其他一些免疫相关通路;（9）Sh RNA介导的lamtor2敲低时,结果显示RAW264.7细胞中TNF-α、1L-1β下调;（10）CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除小鼠RAW264.7系lamtor2和gpr43基因,观察到lamtor2^-/-组RAW264.7细胞在1h时未表现出K.p.菌清除的差异,但是6h和12h后展示出明显的K.p.菌的清除降低,同时观察到未变化的吞噬变化;（11）Western blot检测结果显示发现lamtor2^-/-组与lamtor2^+/+组RAW264.7细胞在感染K.p.后,ERK磷酸化减弱伴随i NOS表达降低,p-P38和p-JNK表达没有变化;（12）RT-q PCR分析lamtor2^-/-组与lamtor2^+/+组RAW264.7细胞在感染K.p.6h后TNF-α、1L-1β、Il-6、Cxcl1和Mcp-1 m RNA表达均降低。结论:（1）肠道菌群耗竭后可加重小鼠K.p.肺炎肺损伤,并且可以加重全身炎症反应,增加死亡率;（2）肠道菌群耗竭可降低K.p.肺炎肺组织中促炎因子和趋化因子水平,减弱机体抗菌反应;（3）补充肠道菌群后可逆转肠道菌群耗竭导致的K.p.肺炎肺损伤,使肠道菌群耗竭小鼠生存时间延长;（4）肠道菌群耗竭后导致小鼠肺泡巨噬细胞在体外吞噬和清除K.p.能力下降;（5）抗生素溶液自由饮食可以耗竭小鼠正常肠道菌群;（6）耗竭的肠道菌群改变了盲肠内容物中代谢,紊乱的代谢主要与碳水化合物和氨基酸代谢有关;（7）关联分析发现,产生SCFAs的菌减少,产生有害代谢产物菌增多;（8）肠道菌群耗竭改变了巨噬细胞转录谱,影响细胞防御反应、抗菌效应及MAPK/ROS信号通路相关基因表达;（9）在肠道菌群耗竭小鼠或是正常菌群小鼠,补充了SCFAs后,均有利于小鼠K.p.肺炎预后;（10）肠道菌群代谢产物SCFAs通过上调LAMTOR2蛋白激活MAPK中ERK信号而不是p-JNK或者p-P38通路促进机体i NOS通路杀菌。