喷施水杨酸可以诱导植物抗逆性相关基因的大量表达，提高植物对逆境胁迫如生物胁迫（如病虫害等）和非生物胁迫（如气象灾害、土壤胁迫等）的抵抗能力，具有绿色、环保、高效的优点，可成为植物病虫害防治和提高逆境适应能力的新途径，分离水杨酸诱导表达的抗病和抗逆性相关基因，对于植物抗逆性的遗传改良和提高植物对逆境胁迫的适应性具有重要的理论意义和实践价值。　　（Prunus salicina Lindli. var cordata J.Y.Zhang et al.）属蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus），是原产福建的名、特、优的核果类果树之一，具有重要的经济价值。本研究以一年生?嫁接苗为材料，用不同浓度的水杨酸喷施叶片，在处理后的不同间取样，提取总RNA；采用稀释池PCR法，筛选?叶片富含全长均一化cDNA文库，获得与水杨酸诱导抗逆性相关的NPR1和WRKY同源基因的全长 cDNA，采用荧光定量 PCR技术，检测这些基因在不同水杨酸浓度和处理时间上表达量的差异，找出抗逆性基因高表达的最佳水杨酸处理条件；用最佳浓度水杨酸喷施?苗叶片，取喷施后30.0 h和0.0 h的叶片为材料，构建DSN介导-抑制差减杂交cDNA文库，采用反向Northern-Blotting筛选差减cDNA文库，获得阳性克隆，对阳性克隆进行测序和生物信息学分析，通过荧光定量PCR检测，验证差异表达的阳性克隆。主要研究结果如下：　　1.叶片NPR1和WRKY同源基因的全长cDNA的分离：采用稀释池PCR法，筛选?叶片富含全长均一化cDNA文库，获得与水杨酸诱导抗逆性相关的4个NPR1和12个WRKY同源基因的全长cDNA，并对这些的基因的序列进行生物信息学分析；并采用荧光定量 PCR技术，比较这些基因在喷施不同浓度水杨酸和不同响应时间的叶片上表达量的动态变化。　　（1）获得了叶片NPR1同源基因的4个全长cDNA，分别命名为PsNPR1、PsNPR3.1、PsNPR3.2和 PsNPR3.3，长度分别为2442 bp、1827bp、1920 bp和2615 bp，ORF长度分别为1794 bp、1777 bp、1773 bp和1788 bp，分别编码596、591、589和594个氨基酸，5-UTR长度分别为534 bp、18 bp、327 bp和573 bp，3-UTR长度分别为114 bp、32 bp、144 bp和254 bp，PsNPR1与沙梨NPR1同源性为84％，PsNPR3.1与苹果NPR3同源性为82%，PsNPR3.2与碧桃NPR3同源性为95%，PsNPR3.3与梅NPR3同源性为98%。氨基酸序列分析结果表明这4个? NPR1同源基因的编码区有BTB/POZ和ANK保守域及NLS核定位信号；系统进化树分析结果表明，?PsNPR1与拟南芥的AtNPR1和AtNPR2聚为一簇，PsNPR3.1、PsNPR3.2和PsNPR3.3与拟南芥的AtNPR3和AtNPR4聚为另一簇。　　（2）获得了?叶WRKY同源基因的12个全长cDNA，分别命名为PsWRKY7、PsWRKY14、PsWRKY20、PsWRKY21、PsWRKY22、PsWRKY29、PsWRKY31、PsWRKY32、PsWRKY33、PsWRKY40、PsWRKY46和PsWRKY75，长度分别为1517 bp、1798 bp、2098 bp、1177 bp、1242 bp、1396 bp、2135 bp、1760 bp、2113 bp、1047 bp、1258 bp和700 bp，ORF长度分别为1095 bp、1572 bp、1764 bp、1068 bp、1071 bp、1002 bp、1944 bp、1602 bp、1770 bp、963 bp、1077 bp、672 bp，分别编码364、523、587、355、357、333、647、533、589、320、358、223个氨基酸。于在拟南芥基因组数据库比对，发现分别最先与AtWRKY7、AtWRKY14、AtWRKY20、AtWRKY21、AtWRKY22、AtWRKY29、AtWRKY31、AtWRKY32、AtWRKY33、AtWRKY40、AtWRKY46、AtWRKY75比对上，均属于WRKY转录因子。氨基酸序列分析结果表明，这些基因均含有WRKY保守结构域，系统进化树分析结果表明，PsWRKY20、PsWRKY32和PsWRKY33属于Group I；PsWRKY7、PsWRKY14、PsWRKY21、PsWRKY22、PsWRKY29、PsWRKY31、PsWRKY40和PsWRKY75属于Group II；PsWRKY46属于Group III。　　2.?叶片喷施水杨酸最适浓度和最佳响应时间的确定：采用荧光定量 PCR技术，比较不同浓度水杨酸（0、0.005、0.05、0.5、1.0和2.0 mM）喷施?叶片后24.0 h PsNPR1表达量的差异，确定水杨酸的最适喷施浓度为1.0 mM，比较1.0 mM水杨酸喷施?叶片后0.0、1.0、3.0、6.0、12.0、24.0、30.0、36.0、48.0和72.0 h，?叶片PsNPR1和PsWRKY表达量的差异，确定水杨酸最佳响应时间，结果表明，除PsWRKY14外，PsNPR1和PsWRKY均在1.0 mM水杨酸喷施后处理后30.0 h表达量最高，因此，?叶片喷施水杨酸的最适浓度为1.0 mM，最佳响应时间为喷施后30.0 h。　　3.外源水杨酸诱导下?叶片抗逆性相关差异基因的分离：以喷施1.0 mM水杨酸后30.0 h和0.0 h的?叶片为材料，构建DSN介导-抑制差减杂交文库，采用反向Northern-blotting技术筛选阳性克隆，根据阳性克隆的测序结果，设计引物，采用荧光定量PCR技术，比较这些阳性克隆在1.0 mM水杨酸喷施后30.0 h和0.0 h表达量的差异，验证外源水杨酸诱导下?含差异基因的阳性克隆，对阳性克隆的测序结果进行生物信息学分析，预测这些差异基因的功能，试验结果表明，DSN处理的最佳浓度为1/2 U，DSN处理产物的LA-PCR扩增的最佳循环数为22，差异cDNA扩增产物集中在0.5-3.0 kb范围内，弥散没有出现亮带，说明DSN处理能有效去除高表达量和相同基因的cDNA，达到差减和均一化的效果，电转化结果表明，所构建的抑制差减cDNA文库的初始滴度为1.7×106 pfu/ mL，随机挑取16个克隆进行菌落PCR验证，结果表明，在1 kb-3 kb范围内，每个菌落均有亮的特异条带，该文库的平均插入片段大小为1.7 kb；随机挑取190个阳性克隆进行反向Northern-blotting，获得了38个阳性克隆，阳性率为20%，阳性克隆测序结果表明，在38条序列中有2条为重复的，冗余率为2.6%；阳性克隆荧光定量PCR结果表明，在37个阳性克隆中，除Ps20和Ps29外，其余阳性克隆基因，这些基因经水杨酸喷施后30.0 h和0.0 h的相对表达量均存在较大差异，这一结果与方向Northern-blotting的筛选结果基本一致。　　将所获得的37个差异基因进行BGI WEGO、BLAST分析与功能注释，结果表明，在这37个差异基因中，有11个参与细胞组成占29.7%、6个参与分子功能占16.2%、19个参与生物进程51.4%、1个为未知基因占0.7%；在这37个差异基因中，有8个基因参与生物胁迫响应，10个基因参与非生物胁迫响应，18个基因参与了响应内源刺激与药物刺激；在这37个差异基因中，有8个转录因子基因参与了生物胁迫与非生物胁迫响应：GRAs家族、乙烯响应结合蛋白基因、TGA、WRKY和bHLH。