背景胶质瘤是起源于胶质细胞或胶质前体细胞的一类肿瘤,为颅内肿瘤中最常见的类型。依恶性程度胶质瘤可划分为不同的亚型。其中,胶质母细胞瘤的恶性程度最高且具有侵袭特性,故预后极差。即使MRI检测到的肿瘤被手术全切除,并辅以放射和化学治疗,其预后仍很差。而且它的侵袭特性易导致肿瘤复发。低级别星形细胞瘤的细胞分裂速度较慢,侵袭性较低,患者预后较好,属于相对良性肿瘤。近年来,人们开展了一系列工作来研究胶质瘤,揭示了某些基因突变和小RNA在胶质瘤中的作用,但由于肿瘤的复杂特性,我们对胶质瘤恶性进展的病理机制仍没有太多认识。蛋白质组学是从整体的角度对生物样品中存在的所有蛋白质进行鉴定和分析的一种新技术。定量蛋白质组学可以对生物样品中的蛋白质进行重复鉴定和准确定量,已成为生命科学领域有效的研究工具。与基因组学和转录组学研究鉴定到的多种癌基因和肿瘤抑制因子相比,蛋白质组学的研究对象是翻译过程合成的蛋白质。而蛋白质是绝大多数生理过程的执行者,因此通过蛋白质组学研究,我们可以对生理过程进行直观分析。传统分子生物学方法,如蛋白印记实验、ELISA等,可同时检测一个或几个蛋白,而典型的蛋白质组学研究能同时将几千个蛋白的信息以数字化的形式呈现。通过对比蛋白质组学分析,我们可以对疾病和正常组织之间以及不同疾病之间差异表达的蛋白质进行分析,进而发现疾病的特异性标记物并可对疾病发生发展的机制进行探讨。传统的蛋白质组学技术因一些固有缺陷,应用受到很大限制。近年来,质谱技术的发展突飞猛进,机器的分辨率不断提高,同时液相色谱串联质谱技术的成熟使我们能够对样品中复杂的蛋白质组分进行高通量和高分辨率的鉴定。目的1.鉴定恶性胶质瘤的分子标记物。2.探讨胶质瘤恶性进展的病理机制。方法1.收集低级别星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的组织样品,病理学家鉴定样品的病理类型并检测了常规用于临床诊断的分子表型。2.使用RIPA裂解液提取样品中的可溶性全蛋白,经透析处理后采用BCA法测定蛋白浓度。3.对样品中的全蛋白进行溶液内酶解,超滤收集肽段后使用碳18柱对样品进行纯化处理。4.纯化所得肽段由高压液相色谱和电喷雾串联离子井质谱仪分离鉴定。肽段于碳18柱中经梯度洗脱,电离化后在阳离子模式下进行分析,所得数据以碰撞诱导分离模式获取。每个样品以相同方法重复检测三次。5.使用蛋白鉴定软件Proteome Discoverer 1.4,运用MASCOT和SEQUEST两种算法对质谱数据进行搜库分析,鉴定样品中的蛋白。6.使用蛋白定量软件Progenesis LC-MS对鉴定到的蛋白进行非标记定量分析。7.使用 STRING(The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)软件对定量所得差异表达蛋白进行功能归类和相互作用网络分析。在蛋白功能归类分析中,在生理过程、分子功能和信号通路等不同层面对差异表达蛋白进行了分类。同时对蛋白之间可能存在的相互作用和关联进行了分析。8.使用蛋白印记实验和免疫组织化学实验对蛋白的差异表达情况进行验证。50微克全蛋白经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,电转至PVDF/NC膜后进行封闭,再用相应的一抗和荧光共轭二抗孵育,扫膜检测信号强度并对数据进行定量分析。9.将特异性针对SF3A1的siRNA和阴性对照siRNA转染入U87、U251细胞系,使用CCK-8实验、细胞划痕实验、transwell侵袭实验研究SF3A1对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;10.分别使用Annexin V和PI双染以及PI染色联合流式细胞术检测SF3A1对胶质瘤细胞周期和凋亡的影响。11.使用针对siRNA位点同义突变质粒采用补救实验的方法检测SF3A1对胶质瘤细胞细胞增殖、迁移和侵袭能力,细胞周期和凋亡的影响。12.使用实时荧光定量PCR实验和蛋白印迹实验研究SF3A1对下游分子的作用。结果1.经液相色谱串联质谱分析,在低级别星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中分别鉴定到2661、2848个蛋白;非标记定量方法检测到136个蛋白的表达水平在两组中存在差异。2.蛋白归类分析显示与RNA加工相关的蛋白在胶质瘤恶性进展中有重要作用。3.相互作用网络分析显示参与RNA加工的胶质母细胞瘤相关蛋白与重要的信号转导分子表皮生长因子受体(EGFR)、信号传导与转录激活因子1(STATl)、丝裂元活化蛋白激酶1(MAPK1)密切相关,后者又与涉及神经结构完整、发育和功能的一组蛋白存在联系。4.蛋白印记实验证实核糖体蛋白S5(RPS5)、铁蛋白重链(FTH1)、STAT1和腱生蛋白R(TNR)在胶质母细胞瘤和低级别星形细胞瘤中的表达存在明显差异。5、免疫组织化学实验证实RPS5和剪接体蛋白SF3A1(Splicing factor 3A subunit 1)在胶质母细胞瘤和低级别星形细胞瘤中的表达存在明显差异。6、我们使用siRNA成功敲除了胶质瘤细胞中的SF3A1,通过CCK-8实验、细胞划痕实验、transwell侵袭实验,证实SF3A1下调会抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。7、我们使用流式细胞术研究了 SF3A1对胶质瘤细胞周期和凋亡的影响,结果显示SF3A1表达降低可引起胶质瘤细胞周期阻滞,并诱发凋亡的发生。8.使用针对siRNA位点同义突变质粒采用补救实验的方法证实SF3A1影响胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力,细胞周期调控以及凋亡诱发。9、实时荧光定量PCR实验和蛋白印迹实验的结果表明SF3A1表达降低可改变MDM4的可变剪接和p53蛋白的表达。结论通过非标记定量蛋白质组学研究,我们鉴定到一组在胶质母细胞瘤和低级别星形细胞瘤中表达存在差异的蛋白,这些蛋白有成为恶性胶质瘤的分子标记物的潜力;同时我们揭示了 RNA加工在胶质瘤恶性进展中发挥重要作用;参与RNA加工的差异表达蛋白与重要的信号转导分子(EGFR、STAT1、MAPK1)密切相关,后者又与涉及神经结构完整、发育和功能的一类分子存在关联。剪接体蛋白SF3A1在胶质母细胞瘤和低级别星形细胞瘤中的表达存在差异。SF3A1可影响胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。SF3A1可通过调节MDM4的可变剪接,对p53的表达进行调控,进而影响细胞周期和凋亡。因此,SF3A1有成为恶性胶质瘤新的分子标记物及潜在治疗靶点的潜力。