研究背景与目的： 人端粒DNA由5’——3’重复序列和一个3’悬突端组成，富含鸟嘌呤重复序列的DNA链在一些小分子化合物的诱导下能够形成G—四链体。 本文主要探讨SYUIQ—5诱导肿瘤细胞发生自噬的分子机制及自噬在其抗肿瘤中的作用。 研究方法： 用MTT法检测SYUIQ—5对肿瘤细胞的增殖抑制作用；免疫印迹法和RT—PCR法分别检测蛋白和mRNA的表达；免疫荧光检测蛋白定位；用MDC染色及YFP—LC3融合蛋白检测细胞内自噬体的形成；用shRNA干扰ATG5，建立ATG5敲除的稳定细胞株；用siRNA干扰BNIP3，检测BNIP3在SYUIQ—5诱导自噬过程中的作用；用分子克隆技术及脂质体转染法建立稳定转染或瞬时转染的细胞株。 研究结果： 1、SYUIQ—5对CNE2、HeLa、SW620细胞体外增殖活性的影响 为了测定SYUIQ—5对肿瘤细胞体外增殖活性的影响，我们用0.31μg/ml—5μg/ml的SYUIQ—5处理CNE2、HeLa、SW620细胞3天，计算SYUIQ—5对肿瘤细胞的增殖抑制率，可见呈明显的剂量效应关系，其IC50值分别为0.93μg/ml、0.55μg/ml、0.20μg/ml。结果显示SYUIQ—5在体外能抑制多种肿瘤细胞的增殖活性。 2、SYUIQ—5诱导肿瘤细胞发生自噬 2.1 SYUIQ—5对肿瘤细胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ转化的影响 多种肿瘤细胞在SYUIQ—5处理后，Western blot检测可见LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达均有增加，LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ表达更强，增加更明显。RT—PCR显示LC3在mRNA水平也有所增强，说明SYUIQ—5处理后能在转录水平增强LC3的表达。表明SYUIQ—5能诱导肿瘤细胞发生自噬，且上调LC3的表达。 2.2 SYUIQ—5诱导自噬体形成 Monodansylcadaverine是一种荧光染料，可与细胞内的酸性囊泡结合，被用作自噬泡的示踪剂，但MDC并不是自噬泡的特异标志物。SYUIQ—5处理后MDC染色增强并呈点状化分布。随后，我们又用免疫荧光观察到在SYUIQ—5处理的细胞中，YFP—LC3融合蛋白的黄色荧光从均匀分布变为点状聚集，YFP—LC3的聚集被认为是自噬体形成的特异性标志。为了定量自噬发生的强度，我们计算了YFP—LC3阳性细胞的比例。以每个细胞中YFP—LC3焦点数≥5为阳性细胞，其比例在对照组的CNE2和HeLa细胞中分别为21.1％和15.9％，而在SYUIQ—5处理组分别达到71.7％和67.2％。 3、SYUIQ—5对端粒结合蛋白的影响 3.1 SYUIQ—5对端粒结合蛋白TRF1、TRF2表达水平的影响 用0.5-4μg/ml的SYUIQ—5作用CNE2和HeLa细胞48小时后，Western blot检测各蛋白表达。结果可见TRF2随着SYUIQ—5浓度的增加表达减少，TRF1在这一过程中无明显改变。为了检测以上端粒结合蛋白的改变是发生在转录水平还是转录后水平，我们用同上的方法处理细胞后用RT—PCR法检测其mRNA水平。TRF1和TRF2的mRNA均无明显变化，说明TRF2的改变发生在转录后水平。 3.2 SYUIQ—5处理前后TRF2在细胞中的定位 用免疫荧光双染法观察TRF2在SYUIQ—5处理前后在细胞中的定位。以TRF1作为端粒的标志，对照组中，TRF2蛋白表达丰富且绝大部分与TRF1共定位，在SYUIQ—5处理24h的细胞中，TRF2表达减少且与TRF1位点分离。说明作为G—四链体配体的SYUIQ—5能使端粒结合蛋白TRF2从端粒解离。 TRF2在SYUIQ—5处理过程中显著减少，为了探究其减少的原因，我们联合蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞后发现，MG-132能使SYUIQ—5引起的TRF2减少得到恢复，说明SYUIQ—5在促使TRF2从端粒结合位点解离后被蛋白酶体水解，从而使端粒失去了TRF2的保护。 4、SYUIQ—5引起端粒DNA损伤 4.1 SYUIQ—5诱导,γ—H2AX表达增高 当用0.5-4μg/ml的SYUIQ—5处理CNE2和HeLa细胞48h后，Western blot检测可见γ—H2AX表达随用药浓度的增高而增强，说明SYUIQ—5能引起DNA双链断裂。免疫荧光也可见到在SYUIQ—5处理的细胞中，γ—H2AX聚集形成的焦点数明显增多。同时，我们计数了γ—H2AX阳性细胞的比例。对照组中的γ—H2AX阳性细胞比例在CNE2和HeLa细胞分别为9.7％和9.2％，而在SYUIQ—5处理组中分别为77.5％和90.7％。 4.2 SYUIQ—5诱导的,γ—H2AX与TRF1共定位 SYUIQ—5能引起γ—H2AX表达增加，说明DNA发生了损伤。那么其损伤是发生在全基因组DNA还是具有位点特异性呢？用免疫荧光双染法检测γ—H2AX在细胞中的定位，仍然用TRF1作为端粒的标志，可见SYUIQ—5处理后，γ—H2AX的绿色荧光大部分与TRF1的红色荧光重叠，说明SYUIQ—5能特异性地引起端粒DNA损伤。 4.3 TRF2过表达对SYUIQ—5诱导DNA损伤及自噬的影响 为了说明TRF2在SYUIQ—5引起的DNA损伤及自噬反应中的作用，我们看到在瞬时转染外源性TRF2使其高表达的肿瘤细胞中，γ—H2AX的表达下调，且LC3的蛋白水平也有所降低；而转染突变型TRF2ΔBΔM的细胞，γ—H2AX和LC3表达均上调，说明野生型TRF2高表达能抑制SYUIQ—5引起的DNA损伤反应和自噬的发生。另外，我们还筛选出TRF2稳定表达的细胞株，MTT结果可见，与转染载体的对照组相比，TRF2高表达细胞在SYUIQ—5的处理下，其增殖能力和细胞活性较强，进一步说明TRF2高表达能对抗SYUIQ—5的细胞毒作用。 4.4 SYUIQ—5诱导的DNA损伤反应和自噬依赖于ATM的激活 SYUIQ—5处理后，ATM被激活发生磷酸化。当用ATM的抑制剂CGK733抑制了ATM的活性后，γ—H2AX的表达也随之减少。说明SYUIQ—5诱导的DNA损伤反应至少是部分依赖于ATM激活的。当用CGK733与SYUIQ—5联合作用于细胞时，能减弱SYUIQ—5对细胞增殖活性的抑制作用，更进一步说明ATM的激活在SYUIQ—5引起的DNA损伤反应中起重要作用。同时，我们发现ATM活性被抑制后，LC3-Ⅱ表达下降，表明自噬被阻断。 5、SYUIQ—5抑制Akt磷酸化诱导FOXO3a核移位 用不同浓度的SYUIQ—5处理CNE2细胞48小时后，Western blot检测发现p—Akt蛋白表达水平明显下降，并呈剂量依赖性，而总的Akt在这一过程中无明显变化。 用0.1％DMSO和3.0μg/ml的SYUIQ—5分别作用CNE2细胞24h后，在共聚焦显微镜下观察FOXO3a在用药前后在细胞中的定位。结果表明，对照组FOXO3a主要在胞浆中分布，SYUIQ—5处理组则显示FOXO3a集中分布在胞核中。 6、SYUIQ—5对自噬相关蛋白的影响 用0.25-2μg/ml的SYUIQ—5分别处理CNE2、CNE1和HONE1细胞48h，0.1％的DMSO为对照，Western blot检测可见BNIP3蛋白表达水平随药物浓度的增加而增加，而mRNA无明显变化。在CNE2细胞中Beclinl无明显改变。 用siRNA干扰BNIP3，24h后再分别用0.1％DMSO或SYUIQ—5处理CNE2细胞24h。Western blot显示BNIP3表达下调后，LC3-Ⅱ的表达也明显减弱，说明BNIP3在SYUIQ—5诱导的细胞自噬中起着重要作用。 7、N—乙酰半胱氨酸抑制SYUIQ—5诱导自噬 ROS是真核细胞有氧呼吸时的产物，包括超氧阴离子、过氧化氢等。ROS可介导细胞信号转导，激活转录因子，促使基因表达，调控细胞生长、增殖和凋亡，发挥重要生物学效应。ROS也可介导自噬的产生。用抗氧化剂NAC拮抗细胞中ROS的产生，能部分抑制LC3-Ⅱ的表达，即抑制了自噬的发生。因此，刺激细胞产生活性氧自由基而诱导细胞自噬可能是SYUIQ—5诱导CNE2细胞发生自噬的机制之一。 8、SYUIQ—5诱导肿瘤细胞自噬性死亡 hp—2和hp—7是针对ATG5的两条shRNA序列。为了明确自噬的发生在SYUIQ—5介导的细胞死亡中的作用，我们建立了稳定转染shATG5的CNE2和HeLa细胞，ATG5表达显著下调，SYUIQ—5诱导的自噬作用也受到阻碍。MTT显示，在转染shATG5的CNE2和HeLa细胞中，SYUIQ—5促进细胞死亡和抑制生长的作用明显减弱，说明SYUIQ—5通过诱导自噬促进肿瘤细胞死亡。 结论： 1、SYUIQ—5使端粒结合蛋白TRF2脱离端粒结合位点并被蛋白酶体水解，引起端粒损伤，激活ATM以及介导自噬相关细胞死亡。 2、SYUIQ—5可通过抑制Akt的激活促进FOXO3a移位到胞核，上调LC3的表达，促进自噬相关死亡。 3、BNIP3表达诱导和ROS产生可以参与SYUIQ—5介导的自噬反应。