目的:角膜的高度透明性和光学性是正常发挥生理功能的必要条件之一,而角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)在维持角膜的正常生理功能方面起重要作用。角膜内皮细胞是角膜后层的单层细胞,构成了后弹力层和房水之间的物理屏障,通过离子“泵”功能调节角膜中离子浓度和水分,维持角膜的半脱水状态,保证角膜的正常厚度和透明度。一旦角膜内皮细胞功能出现紊乱,常导致角膜水肿而使角膜部分甚至完全失去透明性。穿透性角膜移植术是目前取代病变或受损角膜,恢复角膜透明性的主要治疗方法,但供体来源短缺、供体质量的差异、部分排斥反应以及术后并发症等因素严重制约了角膜移植术的普及。研制人工角膜内皮作为人体角膜的等效物是解决上述问题的最有效方法。随着组织工程技术的兴起和发展,组织工程角膜成为诸多学者关注的研究热点。理想的人工角膜内皮应与受体组织有良好的生物相容性,故支架材料的选择是重要的影响因素。壳聚糖是一种聚阳离子多糖,其特有的理化性质已成为医药界及生物医学领域的研究热点。研究证明,壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、降解可控性、抗眼组织纤维化以及抑菌性,在医用材料领域应用前景广阔。生物可降解物质壳聚糖及其衍生物作为角膜细胞载体是一个新的研究方向。本研究旨在探讨壳聚糖及其衍生物作为细胞活性载体进行角膜内皮损伤修复的应用前景。方法:试验分三部分:一、角膜内皮细胞的体外培养:启动兔、狗、猫角膜内皮细胞的原代及传代培养,摸索行之有效的角膜内皮细胞传代、保种方法,同时为得到足量种子细胞,探讨了海洋活性物质对兔角膜内皮细胞的促增殖作用。二、几种壳聚糖共混膜片的兔角膜内皮细胞相容性及其在兔前房组织相容性研究的比较:63101、63102、63103三种不同壳聚糖共混膜片作为载体,进行体外角膜内皮细胞培养,观察细胞相容性、贴附牢固度及膜片强度的观察;30只新西兰白兔分为三组,分别于前房内植入三种膜片,进行裂隙灯、角膜厚度、角膜内皮镜和组织学检查,比较三种共混膜片的前房相容性,另取3只新西兰白兔仅作前房穿刺,作为对照,以期筛选出适合角膜内皮细胞贴附生长、有移植可行性、有良好前房相容性的载体支架。三、兔角膜内皮细胞活性载片的培养及移植研究:选择性能最佳的载体膜片作为载体支架,体外培养兔角膜内皮细胞达适宜密度。取15只新西兰白兔制作兔眼角膜内皮损伤模型,其中3只原位缝合作空白组,其余12只随机分为2组,分别在角膜后弹力层面植入载有兔角膜内皮细胞的壳聚糖共混膜片和不载细胞的壳聚糖共混膜片,作为对照组和试验组,观察兔角膜内皮细胞活性载片对兔角膜内皮损伤的修复能力。结果:一、成功启动了兔角膜内皮细胞原代和传代培养,且此培养方法对于几乎无体内增殖能力的狗、猫角膜内皮细胞同样适用,说明其可能也适用于人角膜内皮细胞的培养;测定了兔角膜内皮细胞的DOT,并通过对细胞贴壁率、伸展率的测定,筛选了行之有效的兔角膜内皮细胞冻存方法;以EGF为对照,发现N-乙酰基葡萄糖和壳寡糖具有促进细胞生长和增殖的良好效果。二、在三种壳聚糖膜片中,63103组膜片与角膜内皮细胞相容性好,细胞可在膜上形成良好单层并且贴附牢固,膜片在经37℃孵育后仍保持良好的机械性能,有手术移植可行性;63103膜片与眼前房组织相容性良好,植入前房后炎症反应轻微。三、扫描电镜显示及LDH释放试验结果表明,生长在63103膜片上的角膜内皮细胞超微结构良好,与生长在细胞培养板上的细胞相比,细胞膜稳定性更佳。试验结果显示,该角膜内皮细胞活性载体膜片在兔眼眼内移植早期,与对照组相比,实验组移植区的透明率较高。结论:本研究中的壳聚糖共混膜作为生物组织工程中的载体支架材料,与角膜内皮细胞具有高亲合力,无毒并能促进细胞的增殖。膜片的理化特性可显著影响其生物组织相容性。生物相容性高的63103膜片能较好地保持角膜内皮细胞的形态和结构,对角膜内皮损伤有一定的修复作用,该细胞活性载片的角膜内皮损伤修复作用有待进一步研究证实。