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目的:探讨多西环素(Doxycycline,DC)对人卵巢癌细胞(SKOV3)及其干细胞样细胞(SKOV3/CSC)的体外影响,并初步探索其抑瘤机制。方法:1体外培养亲本细胞SKOV3(人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞)及其顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP并连续传代,于倒置显微镜下观察细胞形态。采用无血清培养法培养SKOV3/CSC细胞,并以流式细胞仪检SKOV3及SKOV3/CSC细胞CD133表达率,用Aldefluor法检测ALDH酶活性。用MTS法检测不同浓度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)多西环素对SKOV3、SKOV3/CDDP及SKOV3/CSC细胞的抑制率,及低浓度(5μg/ml)多西环素对SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC细胞顺铂敏感性的影响。2以流式细胞仪检测不同浓度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)多西环素处理后的SKOV3及SKOV3/CSC细胞的凋亡率,以及各组细胞线粒体膜电位的变化。并用电子显微镜观察20μg/ml多西环素处理后的SKOV3、SKOV3/CSC细胞超微结构改变。3以Western-Blotting检测不同浓度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)多西环素处理后SKOV3/CSC细胞中Caspase-3、Caspase-9以及胞质中细胞色素C的表达情况。4以Transwell迁移、侵袭实验观察不同浓度多西环素处理后的SKOV3(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)及SKOV3/CSC(0μg/ml、5μg/ml)细胞的迁移及侵袭能力变化。结果:1流式细胞检测结果显示SKOV3、第一、三、五、七、九代SKOV3/CSC细胞的CD133表达率分别为(0.99±0.02)%、(1.11±0.06)%、(1.34±0.05)%(1.26±0.14)%、(1.32±0.07)%、(1.93±0.14)%随着传代次数增加CD133表达率无明显增高,ALDH阳性率分别为(0.35±0.01)%、(0.79±0.02)%、(33.30±0.16)%(67.65±0.44)%、(90.24±0.16)%、(91.66±0.64)%,随着传代次数增加ALDH阳性率显著增高。2 MTS结果显示多西环素可抑制SKOV3、SKOV3/CDDP及SKOV3/CSC细胞体外增殖,并可增加SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC细胞的顺铂敏感性。2.1多西环素抑制SKOV3细胞体外增殖。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西环素作用24h后SKOV3细胞抑制率分别为(-4.39±2.99)%、(-4.32±3.35)%、(11.76±1.73)%、(36.24±2.01)%(P=0.232>0.05、P=0.279>0.05、P=0.001<0.05、P<0.0001),作用48h后抑制率分别为(-3.71±2.20)%、(0.94±0.92)%、(3.18±1.20)%、(47.74±2.35)%(P=0.1487>0.05、P=0.4499>0.05、P<0.0001、P<0.0001),具有剂量、时间依赖性。2.2多西环素抑制SKOV3/CDDP细胞体外增殖。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西环素作用24h后SKOV3/CDDP细胞抑制率分别为(2.38±1.65)%、(11.63±1.23)%、(36.74±1.38)%、(50.54±0.85)%。(P=0.3219>0.05、P=0.0004>0.05、P<0.0001、P<0.0001),48h抑制率分别为(5.57±0.30)%、(18.75±0.25)%、(40.63±0.73)%、(56.77±0.49)%(P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001),具有剂量、时间依赖性。2.3多西环素抑制SKOV3/CSC细胞体外增殖。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西环素作用24h后SKOV3/CSC细胞的抑制率分别为(2.75±0.52)%、(17.28±2.30)%、(26.02±1.70)%、(53.88±2.12)%(P=0.0914>0.05、P=0.0002<0.05、P<0.0001、P<0.0001),48h抑制率分别为(9.68±2.95)%、(23.84±2.87)%、(49.20±2.98)%、(70.58±1.22)%(P=0.0373<0.05、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001),具有剂量、时间依赖性。2.4 SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC细胞比SKOV3细胞对多西环素更加敏感,多西环素对SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC细胞的IC50分别为(36.05±0.05)μg/ml、(36.85±0.13)μg/ml,与SKOV3细胞的IC50(50.32±0.52)μg/ml相比差异具有统计学意义(P<0.0001、P<0.0001)。2.5多西环素可增加SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC细胞顺铂敏感性。经5μg/ml盐酸多西环素处理后SKOV3/CDDP的IC50值由(16.81±0.20)μg/ml下降至(11.12±0.09)μg/ml(P<0.0001),SKOV3/CSC的IC50值由(17.40±0.03)μg/ml下降至(9.36±0.10)μg/ml(P<0.0001)。3流式细胞检测结果显示多西环素可诱导SKOV3、SKOV3/CSC细胞凋亡,导致线粒体膜电位降低。透射电子显微镜结果显示细胞超微结构发生变化。3.1以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西环素作用24h后SKOV3细胞凋亡率分别为(3.89±0.07)%、(3.95±0.06)%、(4.03±0.07)%、(5.53±0.06)%,20μg/ml和40μg/ml组与对照组相比差异有统计学意义(P=0.1266>0.05、P=0.0546>0.05、P<0.027、P<0.0001)3.2以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西环素作用24h后SKOV3/CSC细胞凋亡率分别为(3.45±0.14)%、(8.14±0.21)%、(10.27±0.18)%、(19.55±0.32)%,与对照组相比差异有统计学意义(P=0.7724>0.05、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001)。3.3以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西环素作用24h后SKOV3细胞线粒体膜电位下降分别为(3.81±6.45)%、(21.53±3.72)%、(50.54±4.72)%、(71.67±8.73)%,与对照组相比除5μg/ml组外差异有统计学意义(P=0.6611>0.05、P=0.0242<0.05、P<0.0001、P<0.0001)。3.4 SKOV3/CSC细胞线粒体膜电位下降分别为(15.24±2.83)%、(36.86±3.46)%、(49.57±3.89)%、(96.58±3.42)%,与对照组相比差异有统计学意义(P=0.0085<0.05、P=0.0006<0.05、P=0.0003<0.05、P<0.0001)。3.5透射电子显微镜下观察发现20μg/ml多西环素作用24h后SKOV3细胞线粒体轻度肿胀,嵴断裂,部分膜融合,模糊不清。SKOV3/CSC细胞线粒体中至重度肿胀,线粒体空泡化,部分线粒体髓样化。其他细胞器无明显改变。4 Western-Blotting结果显示以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西环素作用SKOV3/CSC细胞24h后胞质中细胞色素C的相对表达量分别为0.40±0.00、0.52±0.01、0.74±0.001、0.84±0.00与对照组相比差异具有统计学意(P=0.0025<0.05、P=0.0002<0.05、P<0.0001、P<0.0001),Caspase-9的相对表达量分别为0.39±0.00、0.54±0.01、0.73±0.01、0.99±0.00,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001),Caspase-3的相对表达量分别为0.55±0.00、0.69±0.01、0.75±0.00、0.94±0.00与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001)。三者均呈剂量依赖性。5 Transwell迁移、侵袭实验结果显示以5μg/ml、10μg/ml多西环素作用24h后SKOV3迁移能力下降(46.08±4.82)%、(74.41±1.30)%(P<0.0001、P<0.0001),侵袭能力下降(4.31±2.36)%、(40.57±2.79)%(P=0.5103>0.05、P=0.0002<0.05)。以5μg/ml多西环素作用24h后SKOV3/CSC迁移能力下降(29.74±1.74)%(P=0.001<0.05),侵袭能力下降(34.67±3.16)%(P<0.0001)。结论:1多西环素对SKOV3、SKOV3/CDDP及SKOV3/CSC细胞具有增殖抑制作用,且多西环素可增加SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC细胞顺铂敏感性。2多西环素可诱导SKOV3/CSC发生线粒体途径的凋亡。3多西环素除了对SKOV3、SKOV3/CSC细胞具有直接抑制作用之外,还可以降低SKOV3、SKOV3/CSC细胞的迁移、侵袭能力。4无血清培养法可富集ALDH+细胞,可作为SKOV3/CSC细胞富集培养的一种方法。5 CD133不适用于鉴别无血清培养法富集的SKOV3干细胞样细胞。6线粒体可能成为根除卵巢癌的一个新靶点,多西环素作为一种线粒体蛋白合成抑制剂,可能成为除传统化疗药物外的一种新型抗肿瘤药物,为我们最终战胜卵巢癌提供了新的希望。