目的:本实验以辽宁省抚顺市清原县栽培龙胆种子及其一年生幼苗为研究对象,对人工模拟盐胁迫和干旱胁迫条件下龙胆种子、人工模拟不同光照强度和不同温度条件下一年生龙胆幼苗的初生代谢产物、次生代谢产物及其生物合成途径中关键酶基因表达量进行研究,筛选出影响龙胆种子及幼苗生长过程中的主导因子和限制因子,为优化龙胆栽培方法和龙胆药材的质量和产量提供一定的理论依据。材料与方法:1.材料:本课题实验材料为三年生成熟龙胆种子及一年生龙胆幼苗,均采集于辽宁省抚顺市清原县英额门镇英额门村,经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为龙胆Gentiana scabra Bunge。实验用土壤部分收集于与龙胆幼苗对应的栽培基地,部分为市场购买。2.方法:2.1采用直径为9cm的培养皿,纸床作为发芽床,利用不同浓度的分析纯NaCl、PEG-6000,人工营造盐胁迫和干旱胁迫环境,分别对龙胆种子进行培养,并在第2、4、6、8、10、12、15天收集样品。2.2利用人工气候箱在不同光照强度、温度条件下分别对一年生龙胆种苗进行培养,待长势平稳后,于第2、4、6、8、10、12、15天收集样品。2.3采用紫外-分光光度法对样品中初生代谢产物可溶性糖和丙酮酸的含量进行测定。可溶性糖含量采用蒽酮比色法进行测定;丙酮酸含量采用2,4-二硝基苯肼法进行测定。2.4采用高效液相色谱法对样品中裂环环烯醚萜类成分的含量进行研究。由于种子及幼苗中有效成分含量较少,故测定龙胆苦苷,獐牙菜苦苷的含量。2.5通过查阅大量文献及KEGG找出龙胆中有效成分单萜类化合物生物合成途径中的三个关键酶,分别为DXR、DXS、GPPS,并通过NCBI得到三个关键酶和内参基因的序列,利用NCBI Blast和Primer Premier 5.0对引物进行设计。2.6采用RT-PCR法对三个关键酶基因表达量进行测定,采用2^-??Ct法对算出相对基因表达量。2.7利用SPSS 20.0对数据进行Spearman相关性分析、多重比较,利用Excel 2016对数据进行灰色关联分析。结果:1.不同浓度NaCl溶液对龙胆种子可溶性糖、丙酮酸含量的积累与转化具有显著影响,对照组与各处理组之间具有显著性差异（P<0.05）;18mmol/L与36mmol/L两个处理组之间无显著性差异（P>0.05）;72mmol/L与90mmol/L两个处理组之间无显著性差异（P>0.05）。未萌发的种子中检测到龙胆苦苷、獐牙菜苷含量较少,对照组及各处理组之间存在显著性差异（P<0.05）;不同浓度的NaCl溶液对龙胆苦苷、獐牙菜苷含量累积具有显著性影响;对照组与各处理组之间具有显著性差异（P<0.05）;18mmol/L与其它处理组之间具有显著性差异（P<0.05）。对照组与各处理组DXS、DXS、GPPS相对基因表达量均有显著性差异（P<0.05）。2.干旱胁迫下龙胆种子中可溶性糖含量整体呈现先下降后上升的趋势,丙酮酸的含量均呈现下降趋势,对照组与3%、9%、12%三个处理组可溶性糖、丙酮酸含量有显著性差异（P<0.05）,与15%处理组可溶性糖含量有极显著性差异（P<0.01）。龙胆苦苷、獐牙菜苷的含量呈现整体上升的趋势,12%、15%两处理组獐牙菜苷上升趋势无明显差异。对照组獐牙菜苷含量与3%无显著性差异（P>0.05）,龙胆苦苷含量与9%处理组无显著性差异（P>0.05）;12%、15%獐牙菜苷含量无显著性差异（P>0.05）,其余各处理组之间龙胆苦苷、獐牙菜苷含量均有显著性差异（P>0.05）。对照组与各处理组DXS、DXR基因表达量均有显著性差异（P<0.05）,与12%、15%两处理组有极显著性差异（P<0.01）,与6%处理组GPPS基因表达量有显著性差异（P<0.05）。3.不同光照强度下培养的龙胆幼苗中可溶性糖、丙酮酸含量并无显著性差异（P>0.05）。2000Lx与8000Lx、10000Lx两处理组龙胆苦苷含量有显著性差异（P<0.05）,8000Lx与10000Lx龙胆苦苷含量有显著性差异（P<0.05）,10000Lx与各处理组獐牙菜苷含量均有显著性差异（P<0.05）,其余各处理组獐牙菜苷含量均无显著性差异。5000Lx与2000Lx、10000LxDXS基因表达有显著性差异（P<0.05）,其它各组之间无显著性差异;10000Lx处理组DXR、GPPS基因表达量明显高于其它处理组,10000Lx与其它各处理组DXR基因表达有极显著性差异（P<0.01）,而其它各组均无显著性差异;四个处理组之间GPPS基因表达均无显著性差异（P>0.05）。4.不同温度条件下培养的龙胆幼苗10℃处理组与15℃可溶性糖含量有极显著性差异（P<0.01）,与30℃有显著性差异（P<0.05）;15℃、30℃可溶性糖含量与其它各组均呈极显著性差异（P<0.01）。30℃处理组丙酮酸上升趋势较明显,各组之间丙酮酸含量均有极显著性差异（P<0.01）。15℃处理组龙胆苦苷含量与20℃、30℃有极显著性差异（P<0.01）,20℃与25℃处理组有极显著性差异（P<0.01）;10℃獐牙菜苷含量与其它各处理组无显著性差异（P>0.05）,15℃与20℃处理组有显著性差异（P<0.05）,与30℃处理组呈极显著性差异（P<0.01）。DXS基因表达量30℃与其它各处理组均有极显著性差异（P<0.01）,10℃与15℃和20℃两处理组均有显著性差异（P<0.05）,与25℃有极显著性差异（P<0.01）。DXR相对基因表达量10℃与15℃、20℃、25℃处理组均有极显著性差异（P<0.01）,与30℃处理组有显著性差异（P<0.05）;GPPS相对基因表达量10℃与30℃处理组有极显著性差异（P<0.01）;15℃与30℃处理组有极显著性差异（P<0.01）;25℃与30℃处理组有极显著性差异（P<0.01）;20℃处理组与其它各处理组均无显著性差异（P>0.05）。5.灰色关联分析得到,水分含量是影响龙胆种子及幼苗中代谢产物、酶的基因表达的主导因子,盐分含量是限制因子。龙胆种子及幼苗中代谢产物、酶的基因表达与水分含量关系最密切,而与盐分含量、温度、光照强度的密切程度依次减小。结论:1.当盐分浓度达到54mmol/L时强烈抑制龙胆种子萌发过程中的代谢过程。说明龙胆种子萌发过程中需要严格预防土壤的盐渍化,合理施肥,确保龙胆种子在良好的环境中萌发。2.适当的控制土壤水分含量可以提高龙胆种子萌发过程中代谢产物的含量以及酶的基因表达量,在进行龙胆栽培时,应合理灌溉,适当控制土壤水分含量,利于龙胆种子萌发过程中的代谢作用,为龙胆的栽培提供了理论指导。3.当光照强度为8000Lx¹000Lx时,龙胆幼苗中代谢产物的含量及酶的基因表达的起始值明显高于其它组,夏季清原县平均室外光照强度约为40000Lx左右,即在龙胆幼苗期加盖透光率为20%²5%的遮光网较为合理,为龙胆幼苗育苗提供了理论依据。4.龙胆最适生长温度为25℃,温度过低会使植物陷入休眠状态,温度过高会使植物枯萎。为了保证龙胆幼苗期代谢产物的积累,应控制温度约为25℃³0℃。5.龙胆种子及幼苗期代谢产物含量及3种酶的基因表达与本次实验所选环境因子密切程度由强到弱为土壤干旱程度>盐分含量>温度>光照强度。说明土壤干旱程度为龙胆种子及幼苗代谢产物积累及关键酶基因表达的主导因子,而盐分含量则为限制因子。6.影响龙胆种子及幼苗的主导因子是土壤干旱程度,限制因子是土壤盐分含量。在龙胆种子及幼苗的栽培过程中,应对龙胆种子及幼苗进行合理的灌溉,适当控制土壤水分含量,严格控制土壤的盐渍化,防止土壤盐渍化后限制龙胆种子及幼苗的生长发育和生理作用,在龙胆幼苗期应加盖透光率为20%²5%的遮光网,温度可适当控制,避免温度过低导致龙胆种子不能正常萌发,龙胆幼苗不能正常生长发育,为进一步优化龙胆栽培方法提供理论依据。