论文部分内容阅读
磷酸核糖焦磷酸合成酶PRS(负责催化ATP和核糖5磷酸R5P生成AMP与磷酸核糖焦磷酸PRPP)对于核苷酸,脱氧核苷酸以及它们的衍生物的生物合成都是必不可少的。人类的PRS1的单碱基突变与诸多的疾病,诸如高尿酸血症和痛风,CMTX5综合征,Arts综合征,X染色体连锁的非综合的感神经性耳聋DFN2乃至癌症等直接关联。但是PRS1的催化机制和可能的致病机制目前尚不清楚。我们利用X射线晶体学方法解析了人源野生型PRS1、疾病相关突变体的晶体结构,并利用冷冻电镜方法重构了它们的四级结构。结合PRS1或者其与不同底物或者抑制剂分子复合物(PRS1, PRS1-AMPNPP, PRS1-AMPNPP-R5P, PRS1-ADP)的不同构象的负染电镜结构,证实了前人提出的可能PRS1六聚体为其发挥生物学功能单位的推论,提出了四级结构的相互作用界面。综合基因突变、生化分析和序列比对的信息,阐明了其与底物和抑制剂相互作用的区域,提出了一种可能的PRS1催化及产物PRPP释放的机制。该研究结果对于理解由单点突变导致疾病的发生机制具有重要意义并对由PRS1突变引起的疾病治疗和药物设计提供了参考。PRS1D52H突变将会导致病人红细胞中PRPP浓度显著提高并最终引起高尿酸血症和严重的痛风疾病。D52H突变体的晶体结构显示PRS1第52位天冬氨酸被组氨酸替代的突变可能会完全破坏原先其周围稳定的相互作用网络。酶活实验表明D52H突变体和野生型的PRS1具有类似的催化活力。结合结构比对并通过酶活实验和等温滴定微量热实验证实这种相互作用网络的改变会进一步影响病人PRS1的ADP结合口袋的构象并降低其对抑制剂ADP的敏感性。这一结果很好的解释了PRS1D52H突变体的致病机制,同时也是对于上一篇提出模型的验证。与PRS1可能相互作用的蛋白包括PAP39, PAP41, PRS2, PRS3以及p300KIX结构域。PAP39一直都是作为PRS1可能的负调控蛋白被报道,而PRS1与p300KIX结构域相互作用对酶活的影响未见报道。我们通过PAP39pull down实验证实PAP39可以和PRS1在体外以1：1摩尔比相互作用,并分析了它们的酶动力学作用,结果表明,PAP39应该是PRS1的激活蛋白。我们还通过C端6his标签的PRS1pull down实验证实PRS1可以和KIX结构域在体外以1：1摩尔比相互作用。