【摘 要】
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钙是生物的必需元素,而钙离子(Ca2+)是生物机体各项生理活动不可缺少的阳离子。Ca2+在细胞信号转导中作为第二信使传递细胞信号,因此也是细胞信号转导研究的重要对象。为了更有效地实时观察植物细胞中钙离子信号,我们将响应钙离子的水母素（Aequorin,AEQ）基因转化到已由绿色荧光蛋白（GFP）标记了分泌载体膜蛋白SCMP2（secretive carrier membrane proteins
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钙是生物的必需元素,而钙离子(Ca2+)是生物机体各项生理活动不可缺少的阳离子。Ca2+在细胞信号转导中作为第二信使传递细胞信号,因此也是细胞信号转导研究的重要对象。为了更有效地实时观察植物细胞中钙离子信号,我们将响应钙离子的水母素（Aequorin,AEQ）基因转化到已由绿色荧光蛋白（GFP）标记了分泌载体膜蛋白SCMP2（secretive carrier membrane proteins 2）的烟草BY2细胞（SCAMP2-GFP）。经过对转化细胞筛选和分子检测,获得了双价转化的BY2细胞株。转化细胞经腔肠素处理并实时显微观察,能较清晰观察到细胞中钙离子响应的荧光信号。EGTA、乙醇及La Cl3的处理后的荧光观察证明,细胞的荧光信号与Ca2+直接相关。AEQ单价转化的对照BY2细胞则几乎观察不到荧光信号,说明AEQ响应Ca2+并作用于腔肠素所发弱荧光能进一步激发GFP荧光,使AEQ响应钙离子的弱荧光有效增强至可显微直接观察的水平。由此构建的双分子标记的Ca2+响应BY2细胞,可以实现对其细胞内Ca2+的实时研究。比较胞外紫外线直接激发其GFP的荧光（激发荧光）,AEQ响应Ca2+作用于腔肠素所激发GFP荧光（钙离子响应荧光）,后者在约三倍曝光时间下采集荧光亮度相接近。在Ca2+标记的BY2细胞内,结合对其ABP1基因的表达进行调控,开展了植物生长素与钙离子信号相关性的研究。将Ca2+双分子标记系统引入雌二醇诱导ABP1表达的BY2细胞,获得了ABP1过表达（ABP1-ox）、抑制表达（ABP1-anti）等Ca2+标记的BY2细胞株。利用这些细胞株雌二醇诱导处理后,对ABP1基因表达进行定量分析和半定量分析,ABP1-ox过表达细胞基因表达量显著增高,而反义抑制表达的细胞ABP1-anti中基因表达量显著降低,验证了雌二醇对ABP1基因表达调控的有效性。在此基础上对这些细胞株结合生长素处理观察了ABP1调控表达后细胞的Ca2+信号。结果表明,ABP1-ox细胞在生长素处理下,细胞内Ca2+信号能快速响应胞外的生长素作用,将信号转导到细胞,尤其在细胞质膜及细胞核附近均有快速而强烈的Ca2+信号;而ABP1-anti细胞经生长素处理,细胞内的Ca2+信号则较弱,细胞核附近的Ca2+荧光更弱,说明信号的转导受到影响。如果延续雌二醇处理时间,ABP1-anti细胞中ABP1受到过度抑制,细胞中钙离子信号微弱,细胞生长也受到显著影响,表现为细胞生长、伸长和分裂受阻,甚至细胞死亡。鉴于ABP1作为生长素信号受体尚存在较大争议,本研究只证明ABP1参与了生长素信号与Ca2+响应转导的过程,因为过表达和抑制表达该基因都显著影响到细胞中Ca2+的信号转导。如果ABP1能作为生长素受体,其可以直接与Ca2+信号转导相关联;若ABP1并非生长素快速响应的受体,推测ABP1也因其与生长素有很强亲和力,而且其细胞中基因表达水平较高,可以通过与生长素的结合而参与细胞内生长素的稳态调节,影响到细胞内的自由生长素浓度水平。而生长素的浓度水平会影响生长素作用包括Ca2+响应的系列过程,也因此影响到细胞Ca2+的信号转导。
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