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目的:通过研究多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)中Ras相关结构域家族10(RAS association domain family10,RASSF10)基因启动子甲基化状态的变化,分析RASSF10与MM的相关性,探索RASSF10在MM发病机制中的作用。内容:研究MM患者骨髓瘤细胞、MM细胞系的RASSF10基因表达水平以及RASSF10启动子甲基化情况及两者的相关性。研究MM细胞系过表达RASSF10后与MM细胞系相比较对骨髓瘤细胞增殖、凋亡的影响。研究RASSF10对骨髓瘤细胞在裸鼠中成瘤的影响。方法:1.本研究选取我院从2016年6月至2017年8月收治的初治及复发MM患者30例,治疗后疗效达到VGPR及其以上的患者17例,正常对照19例。免疫磁珠分选骨髓单个核细胞中的CD138+细胞,流式细胞术检测免疫磁珠分选CD138+细胞纯度,选用人多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226,OPM-2,U266三株细胞系进行细胞培养。qRT-PCR方法检测CD138+细胞及MM细胞系的RASSF10基因表达水平,比较初治及复发MM患者、治疗后疗效达到VGPR及其以上的MM患者及正常对照组之间RASSF10基因表达水平的差异,分析RASSF10基因的表达水平与初治及复发MM患者总生存期之间的相互关系。比较MM细胞系(RPMI-8226,OPM-2,U266)与正常对照组RASSF10基因表达水平。2.MM细胞系通过慢病毒转染RASSF10,经流式细胞术检测慢病毒转染RASSF10效率,采用qRT-PCR方法检测MM细胞系慢病毒转染RASSF10前后两者之间RASSF10基因表达水平的变化,Western Blot方法检测慢病毒转染RASSF10前后两者之间RASSF10蛋白表达水平的变化,CCK-8方法检测MM细胞系慢病毒转染RASSF10前后肿瘤细胞增殖变化,流式细胞术检测MM细胞系慢病毒转染RASSF10前后肿瘤细胞凋亡比例变化,并应用Western Blot方法检测凋亡相关蛋白的表达。MSP法检测MM细胞系甲基化情况。通过qRT-PCR方法检测MM细胞系经5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理前后的RASSF10基因表达水平的变化。3.选用裸鼠进行MM细胞系慢病毒转染RASSF10前后小鼠成瘤实验,比较过表达RASSF10前后MM细胞系之间裸鼠皮下成瘤大小的差别,并将瘤组织进行病理检测,通过HE染色检测瘤细胞形态,经免疫组化验证骨髓瘤细胞及RASSF10的表达。结果:1.经流式细胞仪检测骨髓单个核细胞分选CD138+细胞的纯度均在90%以上。MM初治及复发组、缓解组及正常对照组骨髓中CD138+细胞RASSF10基因表达水平分别为(0.20±0.29)、(0.64±0.61)、(0.62±0.61),三组之间存在统计学差异(p<0.01)。MM初治及复发组RASSF10基因表达水平明显低于缓解组和正常对照组(p<0.01)。MM缓解组和正常对照组两组间RASSF10基因表达水平无统计学意义(p>0.05)。将初治及复发MM患者RASSF10基因表达水平以0.1分界,随访15月(95%CI 11-18),RASSF10基因表达<0.1的患者OS 10月(95%CI 6-14),RASSF10基因表达>0.1的患者OS 16月(95%CI 12-20)。MM细胞系RPMI-8226、OPM-2、U266中瘤细胞RASSFl0的基因表达水平减低,低于正常对照组。2.多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、OPM-2、U266经慢病毒转染RASSF10的转染效率分别为RPMI-8226 69.3%,OPM-2 58.67%,U266 34.7%,选取RPMI-8226和OPM-2进行后续实验。MM细胞系RPMI-8226转染前后RASSF10基因相对表达量分别为(7.83e-5±1.01e-5)、(5.81e-2±2.72e-3),转染前后比较两组之间具有统计学意义(p<0.01)。MM细胞系OPM-2转染前后RASSF10基因相对表达量分别为(1.05e-5±1.77e-6)、(6.16e-2±1.47e-2),转染前后比较两组之间具有统计学意义(p<0.01);MM细胞系RPMI-8226、OPM-2过表达RASSF10前后检测增殖OD值随时间延长均增高,但过表达前后MM细胞系的检测增殖OD值在48h、72h、96h对照组明显高于过表达RASSF10后的MM细胞系,随时间延长两组之间差距逐渐增加,转染前后24h、48h、72h、96h增殖OD值分别为RPMI-8226(0.94±0.01)、(1.67±0.06)、(1.81±0.06)、(2.17±0.08)和(0.98±0.03)、(1.27±0.08)、(1.28±0.05)、(1.35±0.02);OPM-2(1.34±0.03)、(1.68±0.10)、(1.84±0.03)、(2.38±0.05)和(1.34±0.03)、(1.50±0.04)、(1.62±0.08)、(1.99±0.01),其中48h、72h、96h转染前后两组之间具有统计学意义(p<0.01)。MM细胞系RPMI-8226和OPM-2骨髓瘤细胞RASSF10过表达前后凋亡比例随时间延长均增高,但是过表达前后MM细胞系的凋亡比例在24h、48h、72h、96h对照组均明显低于过表达RASSF10后的MM细胞系,随时间延长两组之间差距逐渐增加,转染前后24h、48h、72h、96h凋亡比例分别为RPMI-8226(27.37±2.67)%、(39.42±3.38)%、(40.97±1.73)%、(47.99±2.62)%和(41.02±4.63)%、(44.76±5.07)%、(52.31±1.23)%、(63.96±8.19)%;OPM-2(17.60±0.99)%、(19.12±2.23)%、(20.25±1.14)%、(24.70±0.78)%和(32.47±2.55)%、(35.26±7.03)%、(33.38±1.72)%、(44.04±1.72)%,其中24h、72h、96h转染前后两组之间均具有统计学意义(p<0.01)。慢病毒转染RASSF10后MM细胞系RPMI-8226、OPM-2蛋白表达,RASSF10,凋亡相关蛋白caspase-3表达上调,而抑制凋亡的蛋白bcl-2在蛋白水平上表达下调。采用MSP方法检测三株MM细胞系RPMI-8226、OPM-2、U266基因启动子甲基化的表达,结果发现RPMI-8226、OPM-2、U266三株细胞系全部高甲基化,经5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理MM细胞系RPMI-8226、OPM-2、U266后,RASSFl0基因表达水平恢复,去甲基化药物处理前后的相对表达量分别为,RPMI-8226(1.57e-5±2.02e-6)和(1.44e-3±7.79e-4),OPM-2(2.95e-5±1.07e-5)和(3.92e-3±1.91e-3),U266(1.53e-6±5.41e-7)和(3.67e-005±1.52e-5),去甲基化药物处理前后比较均具有统计学意义(p<0.05)。3.动物实验给予裸鼠(BALB/c-nu)右肩胛骨处皮下注射多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、OPM-2,其中OPM-2裸鼠皮下成瘤明显,并伴有淋巴结、肝、脾明显肿大,肝脏可见骨髓瘤细胞浸润。RASSF10表达恢复后OPM-2皮下成瘤体积减小,OPM-2对照组成瘤体积和质量分别为(96.97±15.22)mm~3、(87.57±19.75)mg,OPM-2过表达RASSF10成瘤体积和质量分别为(16.56±3.15)mm~3、(19.90±4.60)mg,两组之间存在有统计学意义(p<0.01)。裸鼠皮下形成的瘤组织经HE染色可见大量形态不规则细胞,短梭形或立方形,核不规则,染色粗,核仁不明显;免疫组化:OPM-2对照组CD138约40-50%,RASSF10约30%弱;OPM-2 RASSF10基因表达恢复后CD138约10-20%,RASSF10约50-60%弱。结论:1.MM初治及复发患者RASSF10基因表达水平减低,缓解MM患者RASSF10基因表达水平恢复,与正常对照组比较无差别。表明RASSF10基因表达水平与MM发病有关。且在初治及复发MM患者中RASSF10基因表达明显减低的患者总生存期低于RASSF10基因表达相对高的MM患者。2.MM细胞系RPMI-8226、OPM-2、U266中RASSFl0的基因表达水平均明显减低。RPMI-8226、OPM-2慢病毒转染RASSF10后,其增殖能力下降,凋亡比例增高,凋亡相关蛋白caspase-3表达上调,而凋亡抑制蛋白bcl-2在蛋白水平上表达下调,表明RASSF10可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖并促进其凋亡。利用MSP方法发现RPMI-8226、OPM-2、U266细胞RASSF10基因启动子存在过度甲基化。经5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后RASSFl0基因表达多可恢复,提示RASSFl0基因表达减低与其启动子高甲基化有关,去甲基化药物能逆转基因的表达沉默。3.MM细胞系OPM-2在裸鼠(BALB/c-nu)皮下成瘤明显,淋巴结、肝脏、脾脏均明显增大,肝脏可见骨髓瘤细胞浸润,RASSF10表达恢复后OPM-2皮下成瘤体积减小,瘤质量减低。验证了RASSF10基因对MM细胞具有抑制生长的作用。