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[目的]HEV IgM抗体是急性戊型肝炎的诊断指标,目前其检测方法的灵敏度和特异性急需提高.该实验用辣根过氧化物酶标记多基因型HEV混合重组抗原,建立HEV ELISAIgM抗体捕获法,以便为戊型肝炎实验室诊断和流行病学调查提供简便、灵敏、有效的检测手段.[方法]1.以人IgM为抗原免疫小鼠,取免疫脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合.细胞融合后将抗体阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,建立细胞株.小鼠体内诱生腹水的方法制备抗人IgM单克隆抗体,辛酸—硫酸铵盐析法进行纯化.2.将7种不同基因型和亚型的HEV重组抗原等量混合,过碘酸钠法进行标记,硫酸铵盐析法纯化酶标记混合物,对酶标抗原进行质量鉴定.3.用方阵滴定法在已制备的抗人IgM单克隆抗体中选择包被抗体,并确定最佳抗体包被稀释度和酶标抗原稀释度,选择合适的包被液、标本稀释液、酶标抗原稀释液、标本稀释度,建立HEVIgM抗体捕获法,并对其敏感性、特异性、稳定性和重复性进行评价.[结果]1.获得三株分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株:M<,1>、M<,2>、M<,3>,其分泌的单克隆抗体经亚类鉴定分别为IgG3、IgG2a和IgG1;将腹水抗体纯化后经SDS-PAGE电泳鉴定,在分子量为55KD和25KD处有蛋白带,没有杂蛋白条带.2.HEV混合抗原辣根过氧化物酶标记后工作浓度为1:800;质量鉴定:HRP含量=0.42mg/ml;HEVAg含量=0.34mg/ml;酶/抗原摩尔比=1.4:1.3.选用单克隆抗体M<,3>为包被抗体建立IgM抗体捕获法,并对其进行评价:①特异性捕获HEV IgM抗体的证据:检测3只实验感染非人灵长类动物系列血清,均能检测到HEV IgM抗体阳转,抗体滴度达高峰后逐渐降低,至转阴,而此时HEV IgG抗体仍维持在较高滴度;10份阳性标本DTT处理后检测结果全部阴性.②敏感性和特异性:用该方法检测37份HEV RT-nPCR阳性的肝炎病人血清,结果全部阳性;检测采集自7个国家的血清标本,与美国CDC检测结果比较,总检出符合率为100％;分别检测5份HAV阳性、8份HBV阳性和12份HCV阳性血清标本,结果全部阴性.③检测291份门诊血清标本,与Genelabs公司试剂盒检测结果比较,符合率为94.5％,但有3份标本进口试剂盒检测阳性,该方法未检出,13份标本该方法检测为阳性,进口试剂盒未检出,这13份标本进一步以HEV RT-nPCR检测,得到2份阳性,HEV抗原中和实验全部阳性,说明与Genelabs公司试剂盒相比,该方法检出率更高;检测48份血清标本与该实验室用同样抗原建立的ELISA一步法检测结果进行比较,检出率相同,该方法具有阴性本底低、阳性标本OD值高的特点,总之,该检测方法灵敏度和特异性较好.④稳定性:本试剂在4℃至少稳定6个月,稳定性较好.⑤重复性:批内变异系数和批间变异系数均小于10％,重复性较好.[结论]1.所制备的单克隆抗体M3能特异性地捕获人血清中的IgM类抗体.2.用高纯度和高效价的多基因型HEV混合重组抗原进行辣根过氧化物酶标记,质量符合要求,能够用于建立HEV IgM抗体捕获法.3.所建立的HEV ELISA IgM抗体捕获法具有灵敏、特异、稳定性和重复性好、操作简便的特点,是临床用于HEV IgM抗体检测的有效方法.