【摘 要】
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α-淀粉酶是生物获取能量所需要的重要酶类,在江河生态系统中,鱼类由不同的食性构成食物链体系,不同鱼类的能量获取途径不同,但进化过程中却保持着相似的α-淀粉酶基因序列;研究鱼
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α-淀粉酶是生物获取能量所需要的重要酶类,在江河生态系统中,鱼类由不同的食性构成食物链体系,不同鱼类的能量获取途径不同,但进化过程中却保持着相似的α-淀粉酶基因序列;研究鱼类α-淀粉酶基因的表达调控序列,对揭示鱼类食性功能群机制具有意义。本研究应用染色体步移方法,克隆获得草鱼的α-淀粉酶基因5′侧翼序列,长度为2,063bp。使用网络生物信息学预测软件对草鱼α-淀粉酶基因的5′侧翼序列进行分析,预测草鱼α-淀粉酶基因的启动子区域位于-252~-2bp处;草鱼α-淀粉酶基因转录起始位点(TSS)处于起始密码子(ATG)上游30bp处;预测的草鱼α-淀粉酶基因启动子区域包含有基本的启动子结构元件:TATA盒和CAAT盒。转录因子结合位点分析显示,草鱼α-淀粉酶基因5′侧翼-385bp位点存在HNF3调控元件,序列为:“5-TTTTTTTGT-3”;另外,还发现有5个GR调控元件,其中有一个具有回文结构,序列为“AGTTCTtgttgtTGTTCT”,可能具有应答糖皮质激素诱导的作用。采用相同的方法,克隆得到鱤、鲮和广东鲂α-淀粉酶基因5′侧翼序列,长度分别2,268bp、1,635bp和2,037bp。草鱼、鳡、鲮和广东鲂代表珠江淡水鱼不同食性鱼类,初步研究发现,它们的α-淀粉酶基因5′侧翼序列中,位于起始密码子至5′端上游约240bp区域的序列高度保守,提示鲤科鱼类中,起始密码子至上游约240bp区域是调控该基因表达的基本功能单位。α-淀粉酶基因5′侧翼序列240bp以上的上游区域序列差异较大,可能与不同食性鱼类的α-淀粉酶基因表达差异相关,可能是不同食性鱼类的α-淀粉酶基因表达调控差异的关键序列。α-淀粉酶基因5′侧翼序列构建的进化树结果显示,鲤形目的五种鱼类为一枝,鲈形目的聚为一枝;河鲀的三个拷贝基因为一枝。提示α-淀粉酶基因5′侧翼序列的分化机制在不同目和科的鱼类之间有着不同的模式。由获得的α-淀粉酶基因外显子部分构建的系统进化树反映了α-淀粉酶的进化亲缘远近关系。同为鲤形目的草鱼、斑马鱼和胭脂鱼聚为一类;鲽形目的半滑舌鳎和美洲鲽聚为一类;鲈形目的斜带石斑鱼、真鲷、太平洋黑鲔、尖吻鲈、鳜聚为一类,鲈形目中淡水鱼的鳜聚为一类,其余四种咸水鱼聚为一类。进化树的结果表现为鱼类α-淀粉酶基因在进化序列上的差异整体与传统形态学分类属性相一致。克隆得到的草鱼α-淀粉酶基因的内含子间隔外显子规律遵循“GT-AG”规则,并且内含子序列碱基组成的AT%明显高于外显子。获得的草鱼α-淀粉酶基因外显子部分长度为417bp,推导的α-淀粉酶氨基酸序列中包含有2个α螺旋和3个β折叠,以及3个形成二硫键的Cys位点。
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