论文部分内容阅读
α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶,可以水解人们日常饮食中常见的黄酮苷类化合物,广泛分布于自然界的细菌和真菌中。α-L-鼠李糖苷酶在实际工艺中具有很多潜在的应用价值。本论文选用Enterococcus durans作为发酵菌种,对α-L-鼠李糖苷酶的活性条件测定进行了研究,重点讨论了从发酵液中分离提纯得到α-L-鼠李糖苷酶的主要过程,并研究了纯化后的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质。主要实验结果如下:（1）确定了α-L-鼠李糖苷酶的活性测定条件:在10 mL的比色管中,加入2 mL pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液后,再加入0.1 mL酶液或粗酶液,置于45℃水浴锅中预热5 min,加入0.2mL已经预热的对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷作为底物,反应4 min,反映结束后立即取出并加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3终止反应,冷却至室温后,于400 nm波长处测定吸光值。（2）通过单因素实验以及正交试验对Enterococcus durans产α-L-鼠李糖苷酶的发酵条件进行了优化,得到基础产酶培养基的最佳配比为:蔗糖1.25%,大豆蛋白胨1.25%,磷酸二氢钾2 mmol/L,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,硫酸铁3 mmol/L;相应的产酶发酵条件为:培养基的初始pH为7.0,培养温度为34℃,发酵周期为4 d,摇床转速为180 r/min,250 mL三角瓶装液量为70 mL,接种量为3%。（3）α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化:①实验确定了硫酸铵分级沉淀浓度范围为5080%;②硫酸铵盐析后的沉淀用20 mL 4℃蒸馏水溶解后,装入透析袋,置于4℃蒸馏水中透析约30h后,浓缩至5mL;③采用DEAE-纤维素52阴离子交换层析纯化α-L-鼠李糖苷酶:采用平衡缓冲液的pH为5.0,KCl梯度线性化洗脱浓度为0.2～0.6 mol/L,在KCl浓度低于0.2 mol/L或高于0.6 mol/L时,基本没有蛋白峰洗出。洗脱流速为0.6 mL/min,15 min收集一管,发现收集的第12管中酶活最高,第一蛋白峰没有目的酶活性,为杂蛋白峰,KCl浓度为0.3～0.5 mol/L时,即可把α-L-鼠李糖苷酶洗脱下来。④采用Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化α-L-鼠李糖苷酶:用pH 5.0、浓度0.02 mol/L的醋酸缓冲液洗脱,流速为0.4 mL/min,15 min收集一管,得到三个蛋白峰,第三个为峰为目标峰。（4）对盐析后和凝胶层析纯化后的酶蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为6%。结果表明,盐析并透析后的酶液仍含有很多杂蛋白,经过离子交换层析和凝胶层析后,SDA-PAGE凝胶电泳显示单条带,表明酶蛋白已经得到纯化,并确定酶蛋白的分子量约为90 KDa。（5）纯化后的α-L-鼠李糖苷酶经酶学性质研究发现耐酸性较强并具有较强的耐热性;K+、Mg2+对α-L-鼠李糖苷酶具有明显的激活作用,而Ca2+、Fe2+则对酶具有显著的抑制作用。多数有机溶剂对α-L-鼠李糖苷酶均有一定程度的抑制作用,其中丙酮对α-L-鼠李糖苷酶的抑制作用最强。以对硝基苯基-α‐L‐鼠李糖苷为底物的动力学常数为:Vmax﹦16.13 U/L,Km﹦4.58 mmol/L。