肠道病毒(Enteroviruses)隶属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),是最常见的可引起全球范围内疾病流行的病毒之一,其中人类肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒及一些新型肠道病毒。肠道病毒感染主要通过粪-口和口-口传播。其中,接触感染者粪便污染的水、食物及土壤可以导致粪-口传播。每年全球感染肠道病毒人数可达数百万,可导致一系列临床疾病。肠道病毒的传统检测方法为病毒分离培养,然后进行血清中和试验定型分类,培养结果通常需要1周左右,操作耗时、费用高。因此,建立一种高效、灵敏、快速、简便的肠道病毒检测技术对患者的及时诊治具有重要的指导意义。Notomi T等(2000年)发明了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),该技术具有更高的灵敏度及特异性,缩短了扩增时间,提高了扩增效率,并降低了仪器设备及检测条件的要求。基于此,本研究利用LAMP技术建立了灵敏度高、特异性强的肠道病毒检测新方法,并成功应用于手足口病患儿粪便、饮用水源水及食品包装样品中肠道病毒的检测及饮用水源水样品中脊髓灰质炎病毒的检测。目的:建立肠道病毒通用LAMP检测体系及脊髓灰质炎病毒LAMP检测体系,并分别应用于实际样品中肠道病毒和脊髓灰质炎病毒的定性检测。应用实时RT-LAMP技术对天津市饮用水源水样品中的脊髓灰质炎病毒进行定量检测。方法:1从GenBank中收集肠道病毒基因序列,生物信息学分析得出特异性靶序列,设计出4条特异性引物。恒温条件下经链置换DNA聚合酶扩增。通过调整Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、反应温度等优化反应体系。评价此体系的特异性及灵敏度。将已建立的肠道病毒通用LAMP方法应用于手足口病患儿粪便、饮用水源水及食品包装样品中肠道病毒的检测。LAMP扩增结果可通过肉眼观察白色沉淀或在产物中加入SYBR Green I判定,也可通过内切酶NlaIV酶切及测序确定。2从GenBank中收集脊髓灰质炎病毒基因序列,分析其生物学信息,设计脊髓灰质炎病毒LAMP引物。优化LAMP反应体系,评价该体系的特异性及灵敏度。将已建立的脊髓灰质炎病毒LAMP方法应用于9例天津市饮用水源水样品中脊髓灰质炎病毒的检测。肉眼观察白色沉淀或在产物中加入SYBR Green I判断检测结果。LAMP产物也可通过内切酶HpyCH4III酶切鉴定。同时,随机选取2例样品扩增产物进行序列分析。3应用实时RT-LAMP技术对18例天津市饮用水源水样品中的脊髓灰质炎病毒进行定量检测。结果:1本研究建立的肠道病毒通用LAMP检测方法1-1.5小时即可完成检测。该方法具有良好的特异性,可检测包括肠道病毒71型、柯萨奇A16、B3、B5以及埃可30在内的肠道病毒。其检测下限为101copies/μL,与PCR检测下限一致。样品检测结果表明,此方法对于水源水及粪便样品的检出率较高,分别为9/9(100%)、18/19(94.7%),而4份食品包装样品全部为阴性。产物经NlaIV酶消化后,主要产生103bp、87bp两种片段,与预期结果一致。随机选取的10例样品产物测序表明,2例样品与柯萨奇A16高度同源,8例样品与肠道病毒71型高度同源。2本研究建立的脊髓灰质炎病毒LAMP检测方法1-1.5小时即可完成检测。该方法具有良好的特异性,除脊髓灰质炎病毒外,对其它类型肠道病毒及甲肝病毒均无扩增。其检测下限为101copies/μL,与传统PCR基本一致,但所需设备简单、快速,且结果观测方便。9例饮用水源水样品检测结果表明,8例样品中检测出脊髓灰质炎病毒。产物经HpyCH4III酶消化,主要产生大小为97bp的片段,与预期结果一致。2例样品产物经测序表明均与脊髓灰质炎病毒高度同源。3超滤离心管浓缩方法中病毒的回收率为34.83%。实时RT-LAMP方法对18例水样中的脊髓灰质炎病毒定量检测表明,阳性结果中脊髓灰质炎病毒的浓度范围为7.5×105至1.1×108copies/L。结论:本研究成功建立了肠道病毒通用LAMP检测新方法及脊髓灰质炎病毒LAMP检测新方法,具有简便、快速、特异性好、灵敏度高的特点,为实际样品中肠道病毒和脊髓灰质炎病毒的检测提供了技术平台,在快速检测方面有很好的应用前景。