核糖体是细胞内蛋白质合成的场所,它对细胞生长、组织分化和发育都有十分重要的作用。基因最终是通过核糖体将遗传信息表达出来,所以核糖体在整个生物体的基因表达中扮演重要的角色。大部分的真核生物基因组中,存在着很多的重复基因。在酿酒酵母中,核糖蛋白基因是典型的代表。酿酒酵母的核糖蛋白基因共有137个编码78个核糖蛋白,其中就有59个双拷贝基因和19个单拷贝基因。本课题试图通过探讨真核生物所特有的核糖蛋白RPL36的2个重复基因,RPL36A和RPL36B,来探讨同源基因的功能及其可能的特殊生理意义。为了明确核糖蛋白RPL36A与RPL36B的具体功能,我们构建了只有一种核糖蛋白的菌,如2A、2B;替换核糖蛋白RPL36基因的启动子,试图阻断同源基因间的交流,如用ADH1替换36A启动子、或用ADH1替换36B启动子、36A启动子替换36B启动子、36B启动子替换36A启动子。我们通过spotting assay在平板上观察菌FY251、2A、2B、ADH1替换36A启动子、ADH1替换36B启动子的生长趋势,结果发现只有2A的生长趋势略差,其余的生长趋势与野生型差不多。我们前期的实验结果表明单独只有RPL36A基因的细胞是有生长缺陷的。核糖蛋白RPL36B在野生型背景下,对细胞的重要性比较大。替换启动子的实验结果揭示单独用Adh1启动子改变RPL36A或RPL36B的表达及功能对细胞的生长没有显著的效应。接下来我们在液体培养基中连续培养细胞,检测细胞的生长曲线、核糖蛋白的表达量。实验结果显示在液体培养基中,各不同基因型菌株的生长情况并不像在固体培养基中那样单纯。在液体培养基中,我们观察到了更多样、细致的变化:2A的生长趋势,不如其他的菌;FY251、2B、ADH1替换36A启动子、ADH1替换36B启动子在前期的生长非常近似,但到了 30h后就表现出细微,但是重复的生长差异。我们猜想是由于到了 30h以后,培养基中一些抑制生长的代谢产物的积累,容易利用的碳源耗竭,细胞为了适应不利的生长环境,能量代谢途径发生了改变,如糖酵解,酒精代谢等。由于核糖体组成差异的影响,导致应对胁迫的基因及路径发生改变,反映出生长速率的不同。与此同时,Western结果显示细胞在不同的培养时间点,核糖蛋白RPL36同源基因的表达是有一个动态变化的,这暗示了适度的核糖体组成及多样性对细胞基因的表达及适应不利生长环境是非常关键的。接着我们检测氨基酸饥饿时,核糖蛋白RPL36同源基因的表达情况。实验结果显示在氨基酸饥饿胁迫时,核糖蛋白RPL36A的表达量相对降低了。这暗示在氨基酸胁迫时,由核糖蛋白RPL36同源蛋白所组装的核糖体组成及相对丰度变化可能对调适氨基酸饥饿胁迫所需要的基因翻译过程有一定的影响,而且这种变化趋势与在正常培养基中的变化非常不同。上述的观察引导我们发现一个非常有趣且有意义的现象,就是用Adh1启动子替换核糖蛋白RPL36A基因的启动子会影响到蛋白的功能。这个现象可以从替换启动子以后的两个RPL36同源基因在polysome中的相对丰度变化、敲除了RPL36B基因的生长状态、以及在两个不同基因型菌株中,同样由RPL36A蛋白组装的核糖体其蛋白组成表现出明显差异的结果得到验证。本论文通过生长曲线测定、Polysome analysis、western blot、spotting assay、报告基因检测、核糖体分离、及质谱分析等试验方法,证明同源核糖蛋白RPL36A与RPL36B具有明显的功能差异,而且这个差异与其基因的结构密切关联。为证明“ribosome code”假说提供一个有力的支持。通过本课题研究,我们认为同源核糖蛋白之间不只是简单的功能重复,而是每个单独的核糖蛋白都有其特殊的功能。这些结果也改变了传统蛋白功能是由蛋白氨基酸序列决定的观念,为研究蛋白功能与调节的方向开辟了一个新的领域。