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根据已发表的黄瓜花叶病毒（CMV）Fny RNA2基因序列，设计了全长的2a复制酶（Replicase）基因的特异引物，以CMV Fny RNA2 cDNA的克隆pFny209为模板，进行PCR扩增，得到全长2.5kb的2a复制酶基因扩增产物（RP）。对此产物进行纯化，并用NcoⅠ和BspHⅠ进行双酶切，得到三个片段。将不含有GDD保守区的两个片段用T4 DNA连接酶连接，并对连接产物进行PCR扩增，得到2.2kb左右的缺失GDD保守区的CMV 2a复制酶基因扩增产物（RP△GDD）。以CMV P1 RNA2基因组为模板，根据CMV Fny RNA2基因组的发表序列设计引物，进行PCR扩增，得到5’端及3’端分别缺失的2a复制酶基因（P1-RP）。将三个不同长度的2a复制酶基因片断克隆到pGEM-T Easy Vector上，筛选获得重组质粒pTEVRP、pTEVRP△GDD和pTEVP1-RP。对重组质粒进行序列测定，结果表明序列正确。 将三个复制酶基因重组于植物表达载体中，构建植物基因转化载体系统。用SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒pTEVRP和pTEVRP△GDD双酶切，获得全长的（RP）及缺失GDD保守区的2a复制酶基因片段（RP△GDD）；用SmaⅠ和XbaⅠ对重组质粒PTEVP1-RP双酶切获得5’端及3’端分别缺失的复制酶基因片段（P1-RP）。将这些目的基因片段定向克隆到植物表达载体pBI121中，PCR及酶切鉴定重组质粒正确。由此获得了不同长度的2a复制酶基因的植物表达载体pBIRP、pBIRP△GDD和pBIP1-RP。 通过三亲交配法分别将三个植物表达载休导入根癌农杆菌EHA105中，PCR及酶切鉴定，证实质粒均已导入农杆菌菌株。 通过叶盘转化法，获得了转化CMV P1-RP基因的烟草植株。对10株转基因烟草进行PCR检测，9株能够扩增出目的基因。取PCR鉴定为阳性的3个植株，进行Southernblot印迹分析，其杂交结果均为阳性，该结果表明CMV P1-RP基因已整合于烟草基因组DNA中。对3株烟草的Northern blot印迹杂交结果也为阳性，表明转入烟草的CMVP1-RP基因已在受体植物中转录表达。 建立了番茄亲本B-1的遗传转化体系，找到了适宜番茄B-1分化的培养基及最佳l 激素比率，芽的分化率（叶盘上形成的芽数与叶盘的比）可达500％以上。l 通过叶盘转化法，同样获得了转化CMV Fnv全长的 Za复制酶基因的番茄植株。l 对 10株转基因番茄进行 PCR检测，有 7株能够扩增出目的基因。取 3株 PCR鉴定为l 阳性的植株，进行 S。uthm hi仇印迹分析，其杂交结果均为阳性，而且其中 1株存在l 多拷贝，表明 CMV Ffiy Za复制酶基因已整合于番茄基因组 DNA中。对 3株番茄的INorthern blot印迹分析发现2株杂交信号为阳性，表明转入番茄的CMV Ffly Za复制D 酶基因已在部分受体植物中得到表达。l 用 CMV PI株系和 CMV RB株系接种转基因植物，通过症状观察和 ELISA检测，l 转基因植株有三种不同的抗性反应。即症状严重型；症状延迟型；无症状型。ELISAl 测定结果也表明，一部分转基因植物对 CMV PI株系和 CMV RB株系没有抗性；一部D 分转基因植物具有延迟发病作用；少部分转基因植物具有抗病作用。有关抗性机理的0 研究正在进行中。D 导入TOMV、TMV移动蛋白基因的烟草和导入CMV PI－RP复制酶基因的烟草，分【别经组织培养扩繁并移栽于温室中。4－5叶期分别接种CMVRB株系、PVX、PVY、lITMV，并以非转化普通烟为对照。症状观察表明，病毒在转基因植株上的症状与对照植lD 株上的症状无明显差异，ELISA测定也表明转化植株体内病毒的含量与对照相近。 将导入ToMV移动蛋白基因的烟草接种TMV，一个月后取其系统叶接种心叶烟D 和三生烟（NN基因型），并以TMV接种心叶烟和三生烟为对照。症状观察结果表明l 两者接种的JL’叶烟和三生烟病斑大小相近、病斑颜色相同。随后10个月中定期取系统D 叶接种心叶烟和三生烟，观察病斑大小的变化，没有发现所转基因与接种病毒之间的D 重组。将导入CMV PI．RP复制酶基因的烟草接种CMV RB株系，一个月后取其系统l 叶接种蚕豆，并以CMV RB株系接种蚕豆为对照。结果表明两者接种的蚕豆病斑大小 l 相同。随后6个月中定期取系统叶接种蚕豆，观察病斑大小的变化，也没有发现所转0 基因与接种病毒之间的重组。D